心肌细胞是一种可兴奋细胞,具有产生动作电位(action potential,AP)的能力。心肌细胞的动作电位分为两个时期,即去极化期和复极化期。在动作电位发生期间,不同离子通道的开放和关闭导致不同的离子进行跨细胞膜的流动,从而产生了动作电位的不同时相。在静息状态下,心肌细胞的静息电位大约为-70--90mV,受到适当的刺激后,心肌细胞的静息电位产生去极化并且进一步反极化达到+15-+30mV左右,这一过程称为去极化期。去极化过程结束以后,心肌细胞的膜电位恢复到静息电位水平,这一时期称为复极化期。心肌细胞的复极化期存在着多种不同的跨细胞膜离子流,如Ca2+内流及Cl-内流,最主要的则是多种K+通道介导的K+外流。不同的K+通道参与了动作电位复极化的不同时期,而小电导Ca2+激活K+通道(small-conductance calcium-activated potassium channels, SK)介导的K=外流则参与了复极化过程的中晚期。SK通道是一类非电压门控性的离子通道,细胞内的Ca2+是其唯一的激活途径,因此,SK通道是一种Ca2+激活K+通道(calcium-activated potassium channels,Kca)。根据SK通道对其阻断剂apamin敏感性的不同,SK通道又可划分为4个亚型,即SK1、SK2、SK3和SK4。在心肌细胞,最主要的SK通道是SK2通道,并且其在心房肌细胞的表达远远高于心室肌细胞。由于SK2通道参与了心肌细胞动作电位的复极化过程,阻断SK2通道则显著延长动作电位的复极化时程。新近的研究则表明,敲除SK2通道导致心房肌细胞动作电位复极化时程延长,引起心房纤颤、心房扑动等心律失常发生率增高。同其它SK通道类似,SK2通道的激活与细胞内Ca2+有关。心肌细胞动作电位产生期间,细胞内的Ca2+主要有两个来源：细胞膜上的L型电压门控Ca2+通道(L-type voltage-gated Ca2+channels, L-VGCC)介导的细胞外Ca2+内流及肌质网膜上的ryanodine受体(ryanodine receptors, RyRs)介导的肌质网内Ca2+的释放。RyRs是存在于细胞肌质网上的一种Ca2+释放通道,因能与ryanodine特异性结合而得名。根据基因编码的不同,RyRs在哺乳动物有3个亚型,即RyRl、RyR2和RyR3,分布于心肌细胞肌质网的主要是RyR2。心肌的肌质网内含有大量的Ca2+,是心肌细胞内的钙库。当心肌细胞产生动作电位时,L-VGCC的开放引起了Ca2+内流。内流的Ca2+作为细胞内信号激活肌质网膜上的RyR2通道,导致肌质网内贮存的Ca2+大量释放进入胞浆中,此过程称为Ca2+诱导的Ca2+释放(Ca2+-induced Ca2+release, CICR).有学者发现,抑制心肌细胞L-VGCC后,SK2通道介导的电流显著降低,而且心肌细胞动作电位复极化时程显著延长,表明L-VGCC介导的Ca2+内流引起了SK2通道的开放进而参与了动作电位的复极化过程。但是在心肌细胞产生动作电位的过程中,RyR2介导的Ca2+释放是否参与了SK2的激活并不清楚。在神经细胞中,RyR介导的Ca2+释放是SK激活的重要途径,但是在心肌细胞中,RyR2对SK2的调节作用未见相关文献报道。为了探讨RyR2-Ca2+释放通道对SK2通道的调节作用,本研究采用离体小鼠心房肌细胞,运用全细胞膜片钳技术和激光共聚焦钙成像技术分别观察了心肌细胞的动作电位和钙瞬变,并且探讨了RyR2对动作电位的时相和钙瞬变的影响。本研究还采用siRNA技术构建了RyR2-shRNA’慢病毒载体,采用荧光实时定量PCR和Western blot技术观察了RyR2-shRNA慢病毒载体对小鼠心肌细胞RyR2表达的影响,并研究了RyR2-shRNA慢病毒载体对心肌细胞动作电位和钙瞬变的影响。第一部分：RyR2对小鼠心肌细胞动作电位的影响研究方法1.采用Langendorff灌流装置分离成年小鼠心房肌细胞：健康成年C57BL/6J小鼠,雌雄不拘,抗凝及麻醉处理后取出心脏,低钙酶消化液及KB液灌流后分离心房与心室,并制备成单个心房肌细胞悬液。2.采用全细胞膜片钳技术记录小鼠心肌细胞的动作电位：拉制玻璃微电极并充灌电极内液,选取状态良好的细胞进行封接,电流钳模式下给予去极化刺激诱导动作电位,测量小鼠心肌细胞动作电位复极化达50%所需的时间(action potential duration at50%, APD50)及复极化达90%所需的时间(action potential duration at90%, APD90). RyR2抑制剂对动作电位的影响,实验分为3组：(1)正常对照组：心肌细胞无任何处理；(2)Ryanodine组：预先加入20μM的ryanodine (RyR2抑制剂)；(3)TG组：预先加入2μM thapsigargin (TG)(钙泵抑制剂)45mmin。其次,观察了SK2通道抑制剂对动作电位的影响,实验分为3组：(1)apamin组：上述正常对照组中记录动作电位后,加入500pM apamin后继续进行动作电位的记录；(2) ryanodine+apamin组：ryanodine组中记录动作电位后,再加入apamin后继续进行动作电位的记录；(3) TG+apamin组：TG组中记录动作电位后,再加入apamin后继续进行动作电位的记录。在以上三组中,分别将加入apamin后的APD50和APD90减去加入apamin前的APD50和APD90,求得各组中(正常对照组、ryanodine组和TG组)apamin敏感的APD50和APD90。3.采用激光共聚焦钙成像技术观察了小鼠心肌细胞内的钙瞬变：心房肌细胞悬液梯度复钙,并加入终浓度为5μM的Fluo-3AM,37℃避光孵育30min后台氏液冲洗三次,局部场刺激诱发钙瞬变,采用激光共聚焦扫描系统记录Ca2+Image(激发波长为488nm)。实验分为以下3组：(1)正常对照组：不加任何处理因素；(2) Ryanodine组：加入20μM ryanodine;(3)TG组：加入2μMTG。实验结果1.在正常对照组,小鼠心肌细胞动作电位复极化50%所需的时间(APD50)约为13.7±1.9ms,APD90约为156.5±44.7ms(11=5)。预先加入ryanodine (n=5)或TG(n=5),小鼠心肌细胞动作电位APD50无显著改变(P>0.05),APD90显著延长(P<0.01)。2.在正常对照组,加入apamin后(apamin组),小鼠心肌细胞动作电位的APD50无显著改变(P>0.05),APD90显著延长(P<0.001),apamin敏感APD90为113.6±22.2ms。3.在ryanodine组(ryanodine+apamin)中,加入apamin后,小鼠心肌细胞动作电位的APD50无显著改变(P>0.05),APD90显著延长(P<0.05),apamin敏感APD90为51.2±6.4ms,同正常对照组相比,apamin敏感APD90显著减小(P<0.01)。4.在TG组(TG+apamin组)中,加入apamin后,小鼠心肌细胞动作电位的APD50无显著改变(P>0.05),APD90显著延长(P<0.05),apamin敏感APD90为38.4±6.6ms,同正常对照组相比,apamin敏感APD90显著减小(P<0.01)。5.同apamin组相比,ryanodine组和TG组的APD50无显著改变(P>0.05),但是APD90显著缩短(P<0.05)。同apamin组相比,ryanodine+apamin组和TG+apamin组的APD50和APD90均无显著改变(P>0.05)。6.给予小鼠心房肌细胞局部场刺激,心房肌细胞产生钙瞬变,其增加的峰值约1。13±0.29(F/Fo)(n=8)。预先加入20μM的ryanodine,给予心房肌细胞局部场刺激,钙瞬变的峰值约0.32±0.19(F/F0)(n=8),显著低于对照组(P<0.01)。预先加入2μM的TG45min后,给予心肌细胞局部场电刺激,钙瞬变的峰值约为0.344±0.21(F/Fo)(n=10),显著低于对照组(P<0.01)。小结1.SK2通道参与心肌细胞动作电位复极化的构成,阻断SK2通道使动作电位复极化明显延长。2. RyR2-Ca2+释放参与SK2通道的调节,采用Ryanodine或TG阻断RyR2-Ca2+释放均使动作电位复极化明显延长。3. Ryanodine或TG可明显抑制细胞内钙瞬变幅度。实验结论在小鼠心肌细胞AP复极化过程中,SK2通道的激活与RyR2介导的Ca2+释放有着密切的关系。第二部分：RyR2-siRNA对小鼠心肌细胞动作电位的影响研究方法1.新生小鼠心肌细胞的培养：将新生小鼠心脏取出,剪碎,胶原蛋白酶和胰蛋白酶消化,差速贴壁法纯化心肌细胞。2. RyR2-shRNA慢病毒载体的构建：按照siRNA的设计原则,针对小鼠RyR2基因的不同位点设计并合成4对shRNA片段,将其插入慢病毒载体psiHIV-U6-EGFP的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点。测序鉴定后,分别命名为psiHIV-U6-shRNA1-4。在293T细胞中包装病毒并采用逐孔稀释法检测滴度,获得慢病毒分别命名为Lenti-siRyR2-1-4。利用慢病毒及对照病毒感染小鼠心肌细胞,48h后于倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(EGFP)表达,流式细胞仪检测EGFP阳性细胞百分比。3.荧光实时定量PCR (qRT-PCR)检测RyR2mRNA水平：慢病毒感染48h后,提取细胞总RNA,检测RNA的完整性,进行逆转录反应,进行RyR2mRNA的相对定量分析；4.采用改良Langendorff灌流装置分离成年小鼠心房肌细胞：健康成年C57BL/6J小鼠,雌雄不拘,抗凝及麻醉处理后取出心脏,低钙酶消化液及KB液灌流后分离心房,制备心房肌细胞悬液。5.重组慢病毒载体感染成年小鼠心房肌细胞：将成年小鼠心房肌细胞置于含胎牛血清的培养基中培养1h后,再用不含胎牛血清的培养基换液,加入慢病毒继续培养48h。6. Western blot检测：原代培养成年小鼠心房肌细胞,慢病毒感染48h后提取蛋白,经蛋白电泳和转膜后,依次加入一抗、二抗孵育,ECL法显影并进行图像分析。7.全细胞膜片钳技术记录成年小鼠心肌细胞的动作电位：拉制玻璃微电极并充灌电极内液,选取有绿色荧光的心房肌细胞进行封接,电流钳模式下记录AP,测量APD50及APD90。首先观察RyR2对AP的影响,实验分为3组：(1)空白对照组：心肌细胞无任何处理；(2)阴性对照组：scramble siRNA感染心肌细胞48h；(3)siRyR2组：Lenti-siRyR2-2+Lenti-siRyR2-4感染心肌细胞48h。其次观察了SK2通道抑制剂对动作电位的影响,实验分为3组：(1)apamin组：空白对照组中,加入500pM的apamin后继续进行动作电位的记录；(2)阴性对照+apamin组：阴性对照组中,加入500pM apamin后继续进行动作电位的记录；(3) siRyR2+apamin组：siRyR2组中,加入500pM apamin后继续进行动作电位的记录。在以上三组中,分别将加入apamin后的APD50和APD90减去加入apamin前的APD50和APD90,求得各组中(空白对照组、阴性对照组和siRyR2组)apamin敏感的APD50和APD90。8.采用激光共聚焦钙成像技术观察成年小鼠心房肌细胞钙瞬变：心房肌细胞悬液经梯度复钙,加入终浓度为5μM的Fluo-3AM,37℃避光孵育30min后台氏液冲洗三次,局部场刺激诱发钙瞬变并采用激光共聚焦扫描系统记录(激发波长为488nm)。整个实验分为以下3组：(1)空白对照组：不加任何处理因素；(2)阴性对照组：scramble siRNA感染心房肌细胞48h；(3) siRyR2组：Lenti-siRyR2-2+Lenti-siRyR2-4感染心房肌细胞48h。实验结果1.DNA测序结果表明成功构建针对小鼠RyR2基因的psiHIV-U6-shRNAl-4。2.收获慢病毒Lenti-siRyR2-1-4的病毒滴度分别为1.2×107IU/ml、1.1×107IU/ml、1.3×107IU/ml、1.4×107IU/ml和1.1×107IU/mlo3.慢病毒Lenti-siRyR2-1-4感染心肌细胞48h后,EGFP阳性细胞百分比分别为79.35%、82.47%、81.62%、87.91%和86.18%。4.慢病毒Lenti-siRyR2-1-4感染心肌细胞后,RyR2mRNA表达量显著下降(P<0.01),其相对表达量分别为0.129±0.051、0.042±0.021、0.079±0.036和0.043±0.019,siRNA干扰效率分别为87.1%、95.8%、92.1%和95.7%。5.慢病毒Lenti-siRyR2-2感染心肌细胞后,RyR2蛋白表达量显著下降(P<0.05)。6.小鼠心肌细胞在正常情况下,其动作电位APD50约13.7±1.9ms, APD90约为156.5±44.7ms(n=5)。Lenti-scramble siRNA处理心房肌细胞48h后(n=5),APD50和APD90均无显著改变(P>0.05)。Lenti-siRyR2-2+Lenti-siRyR2-4处理心肌细胞48h后(n=5),小鼠心肌细胞动作电位APD50无显著改变(P>0.05),APD90显著延长(P<0.01)。7.在空白对照组,加入apamin后(apamin组),小鼠心肌细胞动作电位的APD50无显著改变(P>0.05),APD90显著延长(P<0.001),apamin敏感APD90为113.6±22.2ms。8.在阴性对照组中,加入apamin后(阴性对照+apamin组),小鼠心肌细胞动作电位的APD50无显著改变(P>0.05),APD90显著延长(P<0.001),apamin敏感APD90为103.6±21.5ms,同空白对照组相比,apamin敏感APD90无显著改变(P>0.05)。9.在siRyR2组中,加入apamin后(siRyR2+apamin组),小鼠心肌细胞动作电位的APD50无显著改变(P>0.05),APD90显著延长(P<0.05),apamin敏感APD90为46.3±11.7ms,同空白对照组相比,apamin敏感APD90显著减小(P<0.01)。10.同apamin组相比, siRyR2组的APD50无显著改变(P>0.05),但是APD90显著缩短(P<0.05),而siRyR2+apamin组的APD50和APD90均无显著改变(P>0.05)。11.正常情况下,给予小鼠心房肌细胞局部场刺激,心房肌细胞产生钙瞬变,的峰值约为1.13±0.29(F/F0)(n=8)。Lenti-scramble siRNA感染心房肌细胞48h后,钙瞬变的峰值约为1.09±0.22(F/Fo)(n=5),同空白对照组相比无显著性差异(P>0.05)。Lenti-siRyR2-2+Lenti-siRyR2-4处理心肌细胞48h后,给予心房肌细胞局部场刺激,钙瞬变的峰值约为0.41±0.12(F/F0)(n=5),显著低于空白对照组和阴性对照组(P<0.01)。小结1.针对小鼠RyR2基因,本研究成功设计并构建了四种RNAi慢病毒载体Lenti-siRyR2-1-4。荧光定量PCR结果证明重组慢病毒载体Lenti-siRyR2-1/2/3/4均能高效特异地沉默RyR2基因,其中以Lenti-siRyR2-2和Lenti-siRyR2-4的效果最佳。2. Lenti-siRyR2-2和Lenti-siRyR2-4转染小鼠心肌细胞后,动作电位复极化延长,亦明显减低钙瞬变幅度,表明SK2的激活可能与RyR2释放的Ca2+有着密切的关系。实验结论1.在小鼠心肌细胞AP复极化过程中,细胞SK2通道的激活可能与RyR2介导的Ca2+释放有关。2.成功构建RyR2-shRNA重组慢病毒载体。