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研究背景:随着我国航天事业快速发展,航天员在轨时间逐渐增加,长期失重飞行对航天员的影响及生理效应防护是航天医学重要的研究方向。太空失重环境所致的心血管系统变化是诸多影响航天员身心健康的因素之一。新近研究表明,航天员暴露于空间站失重环境中6个月,其颈动脉的僵硬度显著增加,增加的程度相当于普通人群在地面10~20年的增龄改变。动脉僵硬度(Arterial stiffness,AS)是动脉管壁发生结构和功能异常最早的可检测指标。它的增加提示血管硬化,是临床多种心血管疾病的一个重要始动因素和发病基础。大量研究证实,动脉僵硬度是不同人群发生心血管疾病和全因死亡率的一项独立预测指标,具有重要的临床价值。脉搏波传播速度(Pulse wave velocity,PWV)被公认为最为有效的无创测定动脉僵硬度的方法。其中颈-股脉搏波传播速度(Carotid-femoral PWV,cfPWV)已作为无创测定动脉僵硬度的“金标准”。以往研究表明,模拟失重可引起动脉区域性重塑:大鼠大脑动脉因脑内高压适应性变化诱发了肥大性变化和血管反应性增强;而内脏和后肢阻力血管发生萎缩性变化,出现血管肌源性收缩和血管反应性降低。但长期模拟失重对大鼠不同部位动脉僵硬度的影响及其特征尚不完全清楚。目前,国内外尚未建立统一的大鼠动脉僵硬度评价方法及测量指标,因此我们拟建立一种基于超声多普勒的大鼠动脉僵硬度评价方法,并利用这种方法研究长期模拟失重对大鼠动脉僵硬度的影响及其特征。此外,大鼠尾部悬吊使后肢去负荷(Hindlimb unloading,HU)是常用的模拟失重动物模型。目前经典的尾吊方法由Morey-Holton等构建,并由张立藩等进行了完善。但该经典尾吊方法要求操作者有较为丰富的大鼠尾套制作经验,能够控制好外层纱布包裹固定鼠尾的松紧程度,否则易出现如缺血坏死或尾套脱落等现象,造成模型构建失败。我们在实验过程中利用塑料网套(塑料网套)改良了大鼠尾套制作方法,显著提高了模型制备的成功率。实验目的:1.建立可靠的大鼠无创动脉僵硬度评价方法。2.研究长期模拟失重对大鼠不同部位动脉僵硬度的影响及其特征。实验方法:1.利用二维及多普勒超声显示并确定大鼠颈动脉、股动脉脉搏波采样点,采用多普勒技术获取该测量点的血流速度频谱。采用斜率法确定血流速度的起始加速处,在频谱上利用时间标尺测量该起始点与心电图R波顶点的时间间隔,即可获得脉搏波传播时间Δt。测量大鼠鼻尖至尾根部的直线距离,在本研究中称之为体长L;解剖暴露大鼠主动脉根部至右侧颈动脉及至右侧股动脉血管走行,精确测量脉搏波传播距离D。将体长、体重、年龄作为变量,通过多元回归分析得到脉搏波传播距离D的无创计算公式。根据PWV=D/Δt计算心-股脉搏波传播速度(hfPWV)、颈-股脉搏波传播速度(cfPWV)和心-颈脉搏波传播速度(hcPWV)。2.采用尾部悬吊法使大鼠后肢去负荷制作大鼠模拟失重模型,改良以往经典大鼠尾套的制作方式,比较改良尾部悬吊与经典尾部悬吊法模型制备的成功率与尾部并发症的发生率。3.采用改良的尾部悬吊方法制备模拟失重大鼠模型,在4周模拟失重结束后的第0天、第3周、第6周利用二维及多普勒超声测量脉搏波传播时间,根据大鼠体长计算脉搏波传播距离,进而计算其心-颈、心-股和颈-股PWV。4.制备大鼠右侧颈动脉、胸主动脉和腹主动脉形态学标本,进行weigert弹性纤维染色观察弹性纤维排列和分布特征;进行苏木素-伊红(HE)染色测量血管壁内膜-中膜厚度和中膜横截面积;进行masson胶原纤维染色,测量胶原纤维含量。采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测大鼠颈动脉中Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白和弹性蛋白mRNA基因表达水平。5.制备大鼠颈动脉离体血管环进行血管舒张功能检测,观察乙酰胆碱和硝普钠引起的血管舒张效应的变化。6.采用Illumina Hiseq 2500高通量测序平台对模拟失重大鼠和对照组大鼠颈动脉进行microRNA(miRNA)测序。对测序数据进行生物信息学分析,进一步利用qRT-PCR检测候选microRNA在模拟失重大鼠和对照大鼠颈动脉中的表达。7.数据采用GraphPad Prism version 6.0统计软件进行统计学分析。两组间计量资料比较采用t检验,两组以上比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),进一步两两比较采用LSD-t检验,总体率的组间比较采用卡方(χ~2)检验,P<0.05有统计学差异。实验结果:1.与对照组大鼠相比,经典尾吊组和改良尾吊组大鼠的比目鱼肌湿重/体重比值显著减少;经典尾吊组大鼠尾部远端出现缺血坏死损伤的发生率为40.0%,尾套脱落的发生率为26.7%,模型成功率为33.3%;与经典尾吊组相比,改良尾吊组大鼠远端缺血坏死率和尾套脱落率显著降低,分别为13.3%和3.3%,模型成功率显著升高,为83.3%(n=30,均P<0.05)。2.有创法精确测量的心-股脉搏波传播距离与大鼠体长存在显著的相关关系(n=200,P<0.0001);心-股脉搏波传播距离与体长存在较高的决定系数(R~2=0.9858),且线性回归方程最为简单,即心-股脉搏波传播距离=0.6086×体长-1.6523(mm)。再引入其他变量后,尽管R~2有极轻微的提高,但回归方程变得相对复杂和繁冗。同理,颈-股脉搏波传播距离可以通过0.4614×体长+1.8335(mm)计算。心-颈脉搏波传播距离可通过0.1472×体长-3.4858(mm)进行计算。通过该公式可无创获得大鼠精确的脉搏波传播距离,为大鼠脉搏波传播速度的测量提供了方法基础。3.4周模拟失重结束后第0天,HU组大鼠心-颈脉搏波传播速度(hcPWV)显著高于Control组(n=8,P<0.05),但心-股脉搏波传播速度(hfPWV)和颈-股脉搏波传播速度(cfPWVP)在两组间无显著差异(n=8,均P>0.05);模拟失重结束后第3周,HU组大鼠hcPWV仍高于Control组(n=8,P<0.01);模拟失重结束后第6周,hcPWV两组间无显著差异(n=8,P>0.05)。4.与Control组相比,HU组大鼠颈动脉内膜-中膜厚度和横截面积均明显增加(n=8,均P<0.01),但胸主动脉和腹主动脉内膜-中膜厚度和横截面积在两组之间无显著差异。Weigert染色结果显示颈动脉、胸主动脉和腹主动脉的血管壁弹性纤维在HU组和Control组的分布均规则有序;Masson染色结果表明,HU组大鼠颈动脉胶原蛋白含量显著增加(n=8,P<0.01),而胸主动脉和腹主动脉的胶原蛋白含量无明显差异(n=8,P>0.05);qRT-PCR的实验结果与上述实验结果相一致:HU组大鼠颈动脉Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白mRNA表达量显著增加(n=8,均P<0.01),但弹性蛋白mRNA表达量无明显差异。5.与Control组相比,乙酰胆碱(ACh)引起的内皮依赖性血管舒张效应在HU组大鼠颈动脉显著减弱,而硝普钠(SNP)引起的内皮非依赖性血管舒张效应在两组之间无显著差别。6.利用高通量测序对HU组和Control组大鼠颈动脉筛选出12个候选miRNAs。经过qRT-PCR验证初步确定2个显著差异表达miRNAs:长期模拟失重导致大鼠颈动脉miR-582-5p表达上调,miR-380-3p表达下调。miR-582-5p可促进血管平滑肌细胞胶原蛋白的表达。结论:1.颈-股脉搏波传播距离、心-股脉搏波传播距离及心-颈脉搏波传播距离的简易计算公式,可以用于大鼠模型动脉PWV的无创测量,为该模型动物动脉僵硬度的无创评价提供了方法学基础。2.长期模拟失重导致大鼠动脉僵硬度增加具有部位差异性:位于心脏水平以上的颈动脉僵硬度增加,血管壁增厚,胶原蛋白合成增加和内皮依赖性舒张功能减弱;而位于心脏水平以下的胸主动脉和腹主动脉僵硬度无显著改变。长期模拟失重导致大鼠动脉僵硬度增加具有可逆性。