一、原代小鼠肝细胞的分离及培养 目的：建立一种操作简单且成本较低的小鼠肝细胞的简易分离方法，以用于原代肝细胞的分离培养的研究，并进一步为生物型人工肝研制奠定实验基础。 方法：选用昆明小鼠作为肝细胞的供体，采用改良胶原酶消化法对小鼠肝脏进行原位灌注，并回收胶原酶溶液循环利用，分离获取小鼠肝细胞进行原代培养；用台盼蓝染色法来检测细胞存活率，在倒置相差显微镜下观察细胞的形态变化。 结果：每只小鼠平均可获取6.58×10~6个肝细胞，平均存活率为64.1％。用含10％新生牛血清的RPMI 1640培养液进行培养，12h后细胞开始贴壁生长，48h伸出伪足，呈现典型的上皮样细胞的外形形态，胞浆内有空泡和脂滴，可以见到双核细胞。相邻细胞伸长的伪足相互连接。在普通培养液中的肝细胞生存时间可达5～7d，之后细胞回缩，体积变小，逐渐死亡并且从培养瓶壁上脱落下来，或者出现其他肝脏的非实质细胞优势生长的现象。 结论：胶原酶原位灌注法可以用于分离原代小鼠肝细胞，并且分离获得的肝细胞存活数目以及细胞活性均能够满足实验观察的需要。 二、营养成分对短期单层培养的原代小鼠肝细胞的形态学 中文摘要 影响。 目的：本研究在普通培养液中添加转铁蛋白、牛胰岛素、烟酷胺、p－琉基乙醇和促肝细胞生长因子，观察这些营养成分对原代短期培养的小鼠肝细胞的形态学的影响，旨在探讨一种适用于原代肝细胞的培养方案。 方法：用胶原酶消化法获取原代小鼠肝细胞，在两种不同的培养液中进行短期单层培养，一种是含 10％新生牛血清的RPMI 1640培养液，简称为普通培养液。一种是在RPMI 1640培养液中加入了 5 11 iml转铁蛋白、5 P g／ml牛胰岛素、10nM烟酚胺、smM卜琉基乙醇，40 11 g／ml促肝细胞生长因子，简称为肝细胞培养液。利用倒置相差显微镜来观察并摄像记录短期培养两种不同的培养液中的小鼠原代肝细胞的形态学的变化。 结果：小鼠肝细胞在接种 12h后开始出现贴壁现象。肝细胞培养液组贴壁的肝细胞数目明显多于普通培养液组，但此时两组培养液中的小鼠肝细胞在形态学上的差异并不显著。接种24h后，两组培养液中的肝细胞的形态学差异开始出现，并且随着培养时间的延长，差异逐渐显著。普通培养液组的肝细胞伸出的伪足数目较少，细胞多呈三角形或梭形，细胞胞体较小，透光度差，且死细胞较多，高倍镜下观察细胞胞浆内有粗大的颗粒状物质，并且有大量的空泡，细胞呈现代谢不良的状态。培养5～7d后，贴壁细胞出现回缩变形，胞核变得模糊，细胞逐渐趋于死亡。而肝细胞培养液组在低倍镜下观察，培养瓶的背景干狰，死细胞较少，贴壁细胞伸出多个伪足，呈多边形。相邻细胞连接成小片状。高倍镜下观察胞浆内容物丰富，颗粒细 2 中文摘要 小均匀，细胞透光度好，胞核圆而且透亮。肝细胞培养液 组的细胞的生活状态可以雏持在 10叫 之内基本不发生 变化。随着培养时间的延长，无论是普通培养液组还是肝 细胞培养液组的细胞均逐渐衰退死亡，或者出现其他的杂 质细胞忧势生长现象。整个培养过程中均未见到明显的肝 细胞数目的增多。 结论：在培养液中添加转铁蛋白、牛胰岛素、烟酚胺、 p－琉基乙醇以及促肝细胞生长因子，可以促进原代小鼠肝 细胞的贴壁生长，并且可以改善肝细胞在体外的代谢，使 之维持良好的生活状态并且延长体外生存时间。