禽偏肺病毒检测方法的建立及流行病学调查

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禽偏肺病毒(Avian Metapneumovrus, aMPV)可感染火鸡引起火鸡鼻气管炎(Turkeyrhinotracheitis, TRT),特征为咳嗽、流鼻涕、气管罗音、泡沫状结膜炎和鼻窦炎。在一些国家,TRT仍然是除禽流感之外对火鸡影响最大的呼吸道疾病。aMPV感染鸡引起肿头综合征(Swollenhead syndrome, SHS),引发呼吸道症状和产蛋量下降。原发感染死亡率不高,但继发感染后,可引起高达25%的死亡率。目前,许多国家都有对该病的报道,中国的周边国家如日本、韩国、以色列等对该病也有报道。为明确该病对中国家禽的影响,本研究建立了aMPV抗体ELISA检测方法和亚群特异性的荧光定量RT-PCR(RRT-PCR)诊断方法,利用建立的ELISA方法,RT-PCR方法和建立的RRT-PCR方法对我国部分地区aMPV展开流行病学调查,旨在分析aMPV的流行规律和建立防控措施。为了进行流行病学研究,首先建立了检测aMPV抗体的间接ELISA方法,对包被浓度、封闭液、血清稀释度、一抗作用时间、温度和二抗作用时间、温度等反应条件进行了优化。检测了340份临床血清样品,与商品化的ELISA试剂盒符合率高达97.01%。该方法快速、灵敏、特异、高通量适合临床样品的检测。针对A、B、C三个亚群aMPV的G基因或SH基因设计3对引物和3条特异性TaqMan探针,建立了三种快速检测aMPV病毒的亚群特异性RRT-PCR。通过对三种RRT-PCR方法的反应条件和反应体系的优化,使得该RRT-PCR方法在1×103~1×109copies·μL-1范围内具有良好的线性关系,且该方法的灵敏度是常规RT-PCR方法的100倍,该方法与其他禽病病毒无交叉反应。结果表明,该方法具有良好的敏感性和特异性,可用于aMPV的定量检测和亚群分类,为aMPV的早期、快速诊断提供了技术手段。为了解我国鸡群aMPV的感染情况,从2010-2013年收集来自黑龙江、吉林、河北、山东、河南、江苏等地区种鸡群的血清和咽喉拭子。通过ELISA方法检测血清,发现种鸡群中普遍存在aMPV抗体,多个种鸡场aMPV感染率高达100%。利用RT-PCR方法检测咽喉拭子1480份,发现仅有5份咽喉拭子为B型aMPV阳性。将齐齐哈尔咽喉拭子样品共计1057份接种鸡胚成纤维细胞(CEF)进行病毒分离,在CEF上传5代,再经Vero细胞传5代,利用RRT-PCR方法检测,仅1份样品为B型aMPV阳性。从细胞培养阳性样品中克隆了F基因和G基因克隆,F基因和G基因进化树分析该阳性样品为B型aMPV。本研究建立了检测aMPV抗体的间接ELISA方法,该方法具有良好的特异性和敏感性。建立了亚群特异性的RRT-PCR方法,该方法可以用于aMPV的早期快速诊断及分型检测。利用建立的ELISA方法检测血清样品发现大多数种鸡场aMPV感染率很高。对咽喉拭子样品检测发现有B型aMPV。齐齐哈尔种鸡场咽喉拭子样品尝试病毒分离后,利用RRT-PCR检测为B型aMPV。通过本次流行病学调查证实种鸡场中确实存在B型aMPV,部分鸡场损失严重,应该通过进一步的研究提出合理的对策和预防措施。
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