目的:　　 有机粉尘(organicdust)主要是指空气中漂浮的有机物颗粒,包括植物、动物和微生物源性的颗粒和微滴。在生产过程中接触各类有机粉尘可引起以呼吸道和肺部炎症为主要表现的一系列呼吸系统疾病,其中以农民肺、甘蔗肺、蘑菇肺和鸟饲养工肺为代表的职业性变态反应性肺泡炎(occupationalallergicalveolitis)等免疫性肺疾病危害较大。工农业生产加工环境中的有机粉尘不仅包括种类繁多的动植物本身所具有的复杂成分,更常常夹杂一些包括真菌和细菌在内的微生物源性的多重致病性物质,其中高浓度真菌污染较普遍。职业性变态反应性肺泡炎是以免疫病理介导的一组疾病的统称,也称外源性变态反应性肺泡炎(extrinsicallergicalveolitis,EAA)或过敏性肺炎(hypersensitivitypneumonitis,HP),以肺间质炎性细胞浸润和肉芽肿形成为其基本病理特征。病理改变表现为急性、亚急性及慢性形式,急性期表现为肺泡和间质的炎性细胞浸润,肺泡腔中淋巴细胞聚集和巨噬细胞增多;亚急性期可出现肉芽肿;反复发作可发展为慢性期,出现不同程度的肺间质纤维化。迄今,职业性变态反应性肺泡炎的发病机制尚不十分清楚,特别是真菌在其所致变态反应性肺泡炎中的作用地位亟待阐明。在工农业产品的生产及加工过程中环境暴露的有机粉尘越来越复杂,严重危害劳动者的健康。研究有机粉尘对机体的危害,以及预防控制对策,是职业病防治工作的一个重要课题。　　 1-3-β-葡聚糖(1-3-β-Glucan)是真菌细胞壁的主要结构成份,为职业环境中真菌暴露的生物标志物。动物实验证实,1-3-β-葡聚糖暴露肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid,BALF)中,早期炎性细胞显著升高,淋巴细胞(CD3+CD4+T细胞)、中性粒细胞占优势,中晚期以巨噬细胞为主;病理观察发现,早期的肺间质中性粒细胞浸润,肺泡间隔增厚,肺泡腔淋巴细胞聚集。中晚期形成肉芽肿,肉芽肿中巨噬细胞聚集,外周主要是淋巴细胞。符合变态反应性肺泡炎的病理特征,被认为是真菌所致变态反应性肺泡炎的实验动物模型。动物实验研究表明,1-3-β-葡聚糖可改变免疫细胞类型及细胞因子产物。1-3-β-葡聚糖暴露,早期BALF中CD3+CD4+T细胞数量逐渐升高,中晚期肺门淋巴结(hilarnode,HLN)中CD3+CD4+T细胞占优势;早期BALF和肺门淋巴结中IL-12p70、IFN-γ及炎症性细胞因子IL-6水平显著升高,出现Th1型细胞免疫应答;暴露中晚期Th2型细胞因子IL-10等表达显著升高,免疫应答向Th2型偏移。此外,一类以表达IL-17为特征的新CD4+T细胞亚群Th17细胞近年来引起了广泛的关注。Th17细胞在过敏性炎症、肺纤维化、器官特异性自身免疫病、器官移植、及肿瘤等疾病的病理发展过程中发挥重要的作用,特别是在炎症发展早期发挥的促炎性作用,提示炎症性疾病中T细胞免疫应答的建立不仅仅有Th1型和Th2型的参与,同时也可能存在Th17型细胞免疫应答。以上研究提示在1-3-β-葡聚糖引起的变态反应性肺部炎症中,可能存在以下免疫应答机制:第一,Th免疫应答参与1-3-β-葡聚糖引起的变态反应性肺部炎症的发生发展过程,其免疫应答的效应机制可能依赖于Th17-Th1-Th2的活化,即多种类型免疫应答间的协调过渡及其相互平衡;第二,Th免疫应答的发生时相和效应强度可能影响1-3-β-葡聚糖引起的变态反应性肺部炎症的病理结局。Th1型免疫应答的有效建立,Th1型与Th17型的相互平衡,以及随后向Th2型免疫应答的适时转化对于变态反应性肺部炎症的进程及结局可能有着重要的影响。这一过程的启动和平衡出现任何紊乱都可能影响疾病的严重程度和/或其进一步的发生发展,因此需要一种免疫调控机制来调节机体的免疫应答。然而,目前关于1-3-β-葡聚糖所致的变态反应性肺部炎症Th连续活化及其相互平衡的调控机制尚未阐明。　　 免疫调控是一个多细胞多因子参与的复杂过程。其中调节性T细胞(CD4+CD25+T细胞,regulatoryTcells,Tregs)发挥了重要的作用。Tregs可有效地维持免疫系统的自稳状态,其数量和/或功能的改变与CD3+CD4+T细胞数量/活性改变及Th免疫应答转变密切相关。Tregs特异地表达叉状头/翅膀状螺旋转录因子(forkheadboxP3,Foxp3)和表面分子CD25、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxicT-lymphocyte-associatedprotein4,CTLA-4)和糖皮质激素诱导肿瘤坏死因子受体(Glucocorticoid-inducedTNFRfamily-relatedreceptor,GITR)。其中,Foxp3对Tregs的发育具有关键作用;CD25、CTLA4和GITR分子参与Tregs功能的发挥。试验表明,Tregs广泛的免疫抑制性主要体现在抑制体内CD3+CD4+T细胞等多种免疫细胞的活化和增殖。Tregs通过其功能相关分子CTLA-4和GITR与其它细胞直接接触,也可分泌抑制性细胞因子IL-10和TGF-β等,或与天然免疫系统最重要的抗原递呈细胞树突状细胞(dendriticcell,DC)相互作用,抑制针对自身抗原反应效应细胞的增殖。目前,对Tregs的认识主要集中于自身免疫性疾病、移植和肿瘤免疫等方面。Th应答效应的差异性明显受控于机体免疫网络的调节机制,即包括细胞因子的交叉修饰和免疫细胞的诱导凋亡。而具有接触或分泌抑制作用的Tregs可能正是在变态反应性肺部炎症生发展过程中处于举足轻重的作用地位。我们有理由推测,Tregs可能正是通过调控Th应答及各种Th应答之间的相互平衡和转化,进而决定变态反应性肺部炎症的进程与结局。但其确切的效应机制尚不清楚,仍需进一步研究。　　 Tregs对Th应答的时效特征如何?Tregs是否通过调控Th应答和Th极化从而影响变态反应性肺部炎症的病理进程?Tregs对Th应答作用靶位及其相关机制如何?Tregs是否通过改变DC表型或抑制DC功能影响Th应答启动?是否通过调控CD4+T细胞的活化或效应T细胞的活性调控免疫应答?　　 为回答上述问题,我们拟利用小鼠1-3-β-葡聚糖暴露模型,特别是采用Tregs体内阻断实验直接观察Tregs在1-3-β-葡聚糖所致肺部炎症过程中的作用地位,通过对比分析不同模型免疫应答的变化特点,以期确立Tregs在Th应答建立和Th极化调控过程中相关的效应机制,旨在为职业性变态反应性肺部炎症的预防和有效控制提供新的理论依据。　　 实验方法:　　 一、应用抗CD25单克隆抗体消除小鼠体内的Tregs　　 C57BL/6小鼠(6-8周,雌性)按体重随机分为三组:葡聚糖抗体组,葡聚糖模型组,对照组。葡聚糖抗体组小鼠经腹腔注射100μganti-CD25mAb,消除小鼠体内Tregs,建立小鼠Tregs消除模型。葡聚糖模型组、对照组C57BL/6小鼠腹腔注射等体积的IgG1同型对照抗体。葡聚糖抗体组、葡聚糖模型组和对照组C57BL/6小鼠分别行非暴露式气管内灌注法灌注酵母多糖(zymosanA)或生理盐水。将各组C57BL/6小鼠分别于灌注后1,7,14,28天处死,收集BALF;摘取肺门淋巴结、脾组织,分别制备单细胞悬液。摘取肺脏,部分保存于-80℃;部分甲醛固定,用于病理实验。　　 二、炎性细胞分类计数　　 将各组动物各个时间点收集的BALF500rpm,40C,离心10min,收集细胞,制备单细胞悬液,取10μl细胞悬液置于细胞计数板上,进行细胞计数。细胞数=(四个大格的细胞总数/4)×104。取400μl细胞悬液,室温1500rpm离心8min,弃上清,加入200μl小牛血清混匀,推片,室温晾干,用甲醇固定,37℃温箱过夜,用Giemsa染液染色,室温15min;蒸馏水背冲,晾干。油镜下计数200个细胞中巨噬细胞,中性粒细胞,淋巴细胞的数量。　　 三、病理切片染色　　 肺组织常规石蜡切片(5μm),进行H&E染色,石蜡切片放入烘箱内烘烤2小时;然后将肺组织切片置于二甲苯中浸泡10min,更换二甲苯后再浸泡10min;梯度浓度酒精浸泡各1min,脱去二甲苯;流水冲洗5min;苏木精染色液浸染10min,自来水冲洗,返蓝;2%盐酸酒精20s至1min;自来水冲洗12到24h;0.5%伊红染液浸染1至2min,流水冲洗;梯度浓度酒精脱水;二甲苯透明,中性树胶封片。观察小鼠肺组织肺间质炎性细胞侵润及肉芽肿的形成改变。　　 四、流式细胞技术　　 取BALF细胞1×106个,应用anti-CD3-Percp,anti-CD4-PE-CY7,anti-CD25-APC荧光抗体,4℃条件下避光孵育30min,3%FBS的PBS清洗细胞两次,破膜液孵育细胞30min,再次清洗细胞两次,应用anti-FOXP3-FITC荧光抗体孵育细胞1h,进行胞内染色。清洗后,加入1%多聚甲醛的PBS300μl,混匀,FACSCantoⅡ流式细胞仪检测,Diva软件进行分析。　　 取脾、肺门淋巴结细胞各1×106个,应用anti-CD3-Percp,anti-CD4-PE-CY7,anti-CD25-APC,anti-CTLA4-PE荧光抗体,4℃条件下避光孵育30min,3%FBS的PBS清洗细胞两次,破膜液孵育细胞30min,再次清洗细胞两次,应用anti-FOXP3-FITC荧光抗体孵育细胞1h,进行胞内染色。清洗后,加入1%多聚甲醛的PBS300μl,混匀,FACSCantoⅡ流式细胞仪检测,Diva软件进行分析。　　 取脾、肺门淋巴结细胞各1×106个,应用anti-CD11c-APC,anti-CD80-FITC,anti-MHCⅡ-PE荧光抗体,4℃条件下避光孵育30min,3%FBS的PBS清洗细胞两次,加入1%多聚甲醛的PBS300μl,混匀,FACSCantoⅡ流式细胞仪检测,Diva软件进行分析。　　 五、实时荧光定量PCR(RealtimePCR)　　 取100mg肺组织,加入1mlTrizol试剂,冰浴匀浆,12000rpm离心10min,将上清转移至新管中,室温静置5min;每管加入200μl氯仿,用力震荡30秒,室温静置3min;4℃,12000rpm,离心15min;吸取上清至新的1.5mlEP管。加入等体积-20℃预冷的异丙醇0.5ml,混匀后室温沉淀10min;4℃,12000rpm离心10min后,弃上清;加入4℃预冷的75%乙醇1ml,洗涤沉淀及离心管壁;4℃,7500rpm离心5min,弃上清;室温干燥15分钟;加入30μlRnase-free水,至完全溶解,测定RNA浓度。应用Takara公司逆转录酶,将2μgRNA逆转录成cDNA,用ABI7500RealtimePCR仪定量测定,相对定量法计算基因的表达水平。　　 六、酶联免疫吸附试验(ELISA)　　 应用eBioscience公司的试剂盒检测,用100μl包被抗体孵育96孔板,4℃过夜,洗板,200μl检测稀释液室温阻断1h,沈板,加入100μl不同浓度标准品或BALF室温孵育2h,洗板,加入检测抗体100μl室温1h,洗板,加入辣根过氧化物酶100μl室温30min,加入底物室温孵育15min,加入终止液,450nm处读板,检测细胞因子的分泌水平。　　 七、免疫荧光检测　　 肺组织切片用0.1MPBS清洗两次,用羊血清(Histostain-PlusKits,ZSBG-BIO)孵育30min以降低非特异性结合。用anti-CD4-PE-CY7染料(BDPharmingen,SanJose,CA,USA)4℃孵育切片过夜。PBS洗三次,用anti-IL17A-AF488染料(eBioscience,SanDiego,CA92121,USA)室温孵育2h,共聚焦激光扫描显微镜(TCSsp2/AOBS,LEICA)观察切片,拍摄图片,Leica共聚焦软件分析切片中表达CD4+IL-17A+细胞。　　 八、统计学分析　　 数据采用SPSS13.0统计学软件进行分析,统计结果表示为mean士S.E.M,采用单因素方差分析比较各组间的统计学差异;当差异有统计学意义时,用SNK法进行组间比较,p＜0.05具有统计学意义。　　 实验结果:　　 一、抗CD25单克隆抗体腹腔注射有效消除小鼠体内CD4+CD25+Tregs　　 葡聚糖抗体组小鼠腹腔注射抗CD25单克隆抗体,葡聚糖模型组及对照组小鼠腹腔注射抗IgG1同型对照抗体。非暴露式气管内灌注1-3-β-葡聚糖及生理盐水。经流式细胞技术检测,灌注后1、7、14、28天葡聚糖抗体组小鼠脾细胞中CD4+CD25+调节性T细胞占CD4+细胞比例较葡聚糖模型组、对照组小鼠显著降低,差别具有统计学意义。腹腔注射CD25抗体有效的消除了小鼠体内CD4+CD25+Tregs。　　 二、Tregs抑制1-3-β-葡聚糖所致肺部炎症中炎性细胞的聚集　　 葡聚糖灌注诱导C57BL/6小鼠肺部产生明显炎症,主要表现为早期多种炎性细胞的聚集,包括中性粒细胞,巨噬细胞和淋巴细胞。灌注1-3-β-葡聚糖后1、7、14、28天,葡聚糖抗体组小鼠BALF中细胞总数持续高于葡聚糖模型组及对照组小鼠;灌注1-3-β-葡聚糖后早期,葡聚糖抗体组中性粒细胞数及淋巴细胞数明显高于葡聚糖模型组和对照组;灌注1-3-β-葡聚糖后中晚期,葡聚糖抗体组巨噬细胞明显高于葡聚糖模型组和对照组。表明Tregs的消除诱导葡聚糖暴露早期中心粒细胞的聚集,葡聚糖暴露中晚期巨噬细胞的聚集。　　 三、Tregs抑制1-3-β-葡聚糖所致肺部炎症的发展　　 葡聚糖模型组小鼠在灌注后,早期肺间质炎性细胞浸润明显,肺间隔增厚;随后肺间质中的炎性细胞逐渐减少,肺间隔逐渐恢复,可观察到细胞性结节。葡聚糖抗体组小鼠在灌注后,早期肺间质细胞大量浸润,其浸润程度明显高于葡聚糖模型组,肺间隔增厚明显且有较大的细胞团块形成;中期仍有大量炎性细胞浸润于肺间质中,肺间隔持续增厚;晚期炎性细胞减少,肺间隔有所恢复,偶可见巨噬细胞聚集成小型细胞性结节。表明Tregs的消除导致肺组织炎性细胞的浸润程度增强。　　 四、1-3-β-葡聚糖诱导小鼠体内Tregs的增加　　 葡聚糖灌注后1、7、14、28天,葡聚糖模型组小鼠BALF、肺门淋巴结、脾中Tregs/CD4+比例较对照组明显升高,BALF、肺门淋巴结中Tregs/CD4+的比例在灌注早期显著增加,随时间逐渐降低,但仍高于对照组,且有统计学意义。脾中Tregs/CD针比例在灌注早期明显高于对照组,但中晚期逐渐恢复至对照组水平。葡聚糖抗体组小鼠各组织中TregS/CD4+比例显著低于葡聚糖模型组。　　 五、Tregs调控1-3-β-葡聚糖所致肺部炎症Th免疫应答　　 灌注葡聚糖后1天,葡聚糖模型组小鼠BALF中IFN-γ的分泌水平较对照组明显增加,而后逐渐降低至对照组水平。葡聚糖抗体组小鼠BALF中IFN-γ的分泌水平却持续较对照组显著增加。葡聚糖模型组小鼠BALF中IL-4的分泌表达在灌注后中晚期逐渐增加,而葡聚糖抗体组IL-4的分泌水平始终保持与对照组相似,低于葡聚糖模型组。　　 葡聚糖灌注后7天,葡聚糖模型组小鼠肺组织中有大量CD4+CD17A+细胞聚集在增厚的肺间隔。葡聚糖抗体组小鼠CD4+CD17A+细胞明显少于葡聚糖模型组,与对照组基本相似。　　 葡聚糖模型组小鼠肺组织中IL-2的表达水平在灌注后1、7、28天均高于对照组,葡聚糖抗体组IL-2的表达水平在各个时间点均高于对照组和葡聚糖模型组。葡聚糖模型组小鼠肺组织IL-4的表达水平在灌注后中晚期较对照组显著增加,而葡聚糖抗体组IL-4的表达水平始终低于葡聚糖模型组。葡聚糖模型组小鼠肺组织IL-17的表达在灌注后各个时间点均高于对照组,葡聚糖抗体组IL-17的表达始终较葡聚糖模型组降低。　　 表明Tregs可以抑制Th1型免疫应答的建立,从而调控Th1/Th2型和Th1/Th17型免疫应答间的相互平衡。　　 六、Tregs直接通过表面分子CTLA-4调控1-3-β-葡聚糖所致肺部炎症Th免疫应答　　 葡聚糖模型组小鼠灌注葡聚糖后早期,肺门淋巴结和脾中表面表达CTLA4的Tregs较对照组明显增加,而后逐渐降低。葡聚糖抗体组淋巴结和脾中表达CTLA4的Tregs显著低于葡聚糖模型组。显示Tregs的免疫抑制功能依赖其表面活性因子CTLA4。　　 七、Tregs通过抑制DC活性影响1-3-β-葡聚糖所致肺部炎症Th免疫应答　　 葡聚糖灌注后早期,葡聚糖模型组肺门淋巴结中表面表达CD80和MHCⅡ的DC较对照组明显增加,随后降低。而葡聚糖抗体组表达CD80和MHCⅡ的DC低于葡聚糖模型组。表明Tregs可能通过抑制DC的活性发挥其免疫抑制功能。　　 八、Tregs间接通过抑制性细胞因子IL-10调控1-3-β-葡聚糖所致肺部炎症Th免疫应答　　 灌注葡聚糖后,葡聚糖模型组小鼠肺组织中IL-10的表达较对照组明显增加,直至灌注后14天;葡聚糖抗体组小鼠肺组织中IL-10的表达显著低于葡聚糖模型组。葡聚糖模型组和葡聚糖抗体组小鼠肺组织中TGF-β的表达均明显高于对照组,但两组之间差异没有统计学意义。表明Tregs免疫抑制功能的发挥依赖抑制性细胞因子IL-10。　　 结论:　　 1、Tregs抑制1-3-β-葡聚糖所致的肺部炎症发生发展的过程。　　 2、Tregs通过抑制Th1型免疫应答、促进Th1型向Th2型过渡,调控Th免疫应答。　　 3、Tregs可通过CTLA-4分子、抑制性细胞因子IL-10及调控DC的活性发挥其免疫抑制作用。