背景与目的:食管癌是(esophageal carcinoma)是发生在食管部位的恶性肿瘤,它的发生率和死亡率在全部恶性肿瘤中占很高的比例,且死亡率在所有恶性肿瘤中位居第五。据不完全统计全世界每年大约有18万人死于食管癌,食管癌的发病率和死亡率在中国很高,每年几乎有10万人死于本病。因此,规范和加强食管癌的早期诊断和后期治疗,使众多的食管癌患者受益,是临床医生的首要任务。目前,通常采用手术切除对食管癌进行治疗,在食管癌早期放疗也可以医治。虽然单方面的化疗效果不明显,但临床上通常将其作为辅助治疗,将手术、放疗和化疗综合使用,确保癌症的治疗效果更佳。恶性肿瘤治疗效果的好坏,主要取决于肿瘤早期是否得到了及时诊断,越早确诊,其治疗成功的概率越大。随着科学的发展,利用特定基因对肿瘤进行诊治已经成为一种新兴的生物学诊治手段,特定基因的寻找对早期肿瘤的诊断、后期的治疗以及术后复发的预防具有潜在的临床意义。因此,对参与肿瘤发生发展的相关基因特性的研究形势就显得日益严峻。肿瘤转移、复发是癌症的重要特征,在肿瘤发生发展过程中,EMT过程能使肿瘤细胞获得一些恶性表型形式,导致细胞与细胞之间及与细胞外基质之间的粘附能力增强,细胞的运动迁移能力提高,细胞无限增殖并伴有明显去分化,不再凋亡并失去接触抑制能力等。通过对参与食管癌发生发展过程中所涉及的特定基因特性和功能的研究,将其应用于对食管癌的临床诊治,是目前生物医学领域解决食管癌病症的一大新的突破。通过本实验室以往对FAK的研究揭示其在多种肿瘤类型中均高度表达,且与恶性肿瘤的发生、发展关系密切。鉴于此,本课题将FAK作为研究对象,探究其与食管癌发生、发展的关系,评估FAK在食管癌发生、发展过程中的作用以及作为食管癌诊治靶标的潜在价值。本研究运用RNAi技术抑制FAK在食管癌细胞Eca-109中的表达水平,研究FAK基因表达与食管癌细胞行为和细胞骨架、细胞形态的关系及参与食管癌EMT过程中相关基因的关系。方法:1.在NCBI数据库检索FAK基因的相关基因信息并在线设计针对FAK的siRNA,检测其特异性,并克隆至质粒pU6H1-GFP,构成pU6Hl-GFP/FAK-siRNA。2.将制备完成的FAK质粒采用磷酸钙转染法转入人食管癌细胞Eca-109中,以野生细胞WT和错义细胞siRNAscr作为对照,转染72h后评估细胞转染效率。3.采用损伤修复法,MTT法,软琼脂克隆形成实验和TransWell实验检测FAK表达被抑制后对Eca-109细胞增殖及迁移能力的影响。4.使用考马斯亮蓝染色,扫描电镜检测FAK表达下调后对Eca-109细胞骨架及表面微结构的影响。5.以Western blot法检测下调FAK的表达水平后,MMP9、VIM、KRTl、E-cadherin的蛋白表达水平。6.以细胞免疫化学法检测FAK表达下调后,MMP9、VIM、KRT1、E-cadherin在细胞水平的表达。7.以生物信息学方法分析探讨FAK、MMP9、VIM、KRT1以及E-cadherin与食管癌发生发展过程中可能存在的联系。结果:1.有针对性地成功构建了靶向FAK的重组质粒并确保细胞的转染效率达85%以上。2.Western blot结果表明FAK siRNA3质粒可以显著降低食管癌Eca-109细胞中FAK的表达水平。3.损伤修复法、TransWell实验、MTT法及软琼脂克隆形成实验结果均表明FAK基因表达被下调后Eca-109细胞增殖和运动能力明显降低。4.考马斯亮蓝染色、扫描电镜实验结果显示FAK基因表达下调后Eca-109细胞间接触抑制有所恢复,细胞骨架和表面微结构有所改变。5.Western blot、细胞免疫化学结果均显示下调FAK基因的表达水平可以明显抑制MMP9、VIM的表达水平,增强KRT1、E-cadherin的表达水平。结论:1.FAK基因的表达水平被抑制后可以显著阻碍Eca-109细胞迁移和增殖的能力,这说明FAK表达对食管癌细胞的转移、增殖等过程有重要的促进作用。2.Western blot、细胞免疫化学实验结果说明FAK基因的表达与MMP9、VIM的表达呈正相关,与KRT1、E-cadherin的表达呈负相关,说明FAK基因参与了食管癌的EMT过程。3.下调FAK的表达水平可以有效恢复Eca-109细胞间接触抑制。4.食管癌临床病例统计数据的生物信息学分析表明,FAK、MMP9、VIM、KRT1、E-cadherin在食管癌的发生发展过程中有着举足轻重的作用。5.本课题通过研究分析食管癌细胞行为特性及EMT相关基因的角度说明了 FAK基因表达与食管癌发生发展有着重要的关系,进一步反映出在食管癌的生物学基因诊治过程中FAK基因具有重要的参考价值。