研究背景冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)已经成为威胁人类健康的三大杀手之一,也是影响人们生活质量的最常见、严重的心血管疾病之一。研究表明,动脉粥样硬化是一种炎症性疾病,在动脉粥样斑块内有大量的巨噬细胞、单核细胞、T淋巴细胞和树突状细胞等炎症细胞的浸润,斑块内炎症反应非常明显；在冠心病的发生发展过程中,不论是从脂质条纹到粥样斑块或纤维斑块,还是不稳定斑块的生成、破裂、血栓形成,始终都有各种炎症细胞的参与。由此可见,抑制炎症细胞活性,通过免疫调节阻断炎症反应通路已成为研究及治疗冠心病的热点和难点。众所周知,炎症反应的活化与T淋巴细胞明显相关,而近年研究表明,负性刺激信号(PD-1/PD-L1)对T淋巴细胞活化起重要作用。JNK又称c-Jun N-末端激酶或者应激活化的蛋白激酶(stress activiated protein kinase, SAPK),是促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)超家族成员之一,是一类丝氨酸/苏氨酸激酶,位于细胞胞质之中,相对分子量为46×103和54×103,存在特定的功能区(Thr-Pro-Tyr),其编码基因为JNK1、JNK2和JNK3,其中JNK1和JNK2存在于全身各组织中,而JNK3主要存在于脑、心脏和睾丸等组织。JNK的活化是通过氨基末端残基磷酸化实现的,而JNK的激活可以受多种细胞外因素的刺激而启动,包括生长因子、细胞因子(IFN-γ、IL-1、TNF-α等)、应激刺激(紫外线、细胞高渗透压、缺血再灌注损伤)等。一旦JNK激活,JNK将由细胞质转入细胞核中,广泛参与细胞凋亡、增殖、代谢及DNA损伤修复等多种生物学反应,而其功能的失调可造成神经退行性病变、缺血再灌注损伤、糖尿病和肿瘤等多种疾病。程序性死亡因子配体1(programmed cell death ligand1, B7-H1、CD274或PD-L1)是由290个氨基酸构成的Ⅰ型跨膜蛋白。PD-L1是B7家族分子的重要成员,它的受体既不是CTLA-4蛋白(cytotoxic T-lymphocyte Antigen4, CTLA-4),也不是ICOS蛋白(inducible co-stimulator, ICOS)和CD28蛋白,其受体为程序性死亡因子1(programmed cell death1receptor,CD279或PD-1)。在最初的研究中发现,PD-L1在肿瘤细胞中有高表达,因此,人们推测PD-L1可能与肿瘤细胞浸润有关；但近年研究表明,除肿瘤细胞以外,PD-L1在许多炎症细胞上均有表达,如T淋巴细胞、B淋巴细胞、Kupffer细胞、巨噬细胞、星形细胞、血管内皮细胞、树突状细胞、胎盘合体滋养层细胞等等；PD-L1的功能除与肿瘤细胞浸润明显相关以外,还与多种疾病发生有密切的关系,如移植免疫反应、微生物感染(病毒感染)、自身免疫性疾病,近年来研究还发现与动脉粥样斑块形成也明显有关。Gotsman等用荧光免疫技术研究冠状动脉时发现,PD-L1表达于多处动脉粥样斑块内。Lee等研究也发现,冠心病患者较正常人相比,T淋巴细胞及树突状细胞PD-1/PD-L1表达均显著降低,而T淋巴细胞增殖能力却增强,证实PD-L1/PD-1与致动脉粥样硬化性T淋巴细胞免疫调节有着密切联系,能够负性信号调控冠状动脉粥样斑块形成,在冠心病的发生、发展中起着重要作用。虽然现在对PD-Ll的功能有了一定了解,但对于PD-1/PD-L1细胞内信号通路的转导机制目前尚不明了。不同研究对象及使用不同刺激物所得出结果不完全相同,总的来说,影响PD-L1表达的细胞信号通路可能为PI3K/Akt信号通路、JAK/STAT信号通路、NPM/ALK通路、MEK/Erk信号通路,以及与STAT-3和IRF-1转录因子有关。众所周知,JNK信号通路是MAPK通路的重要分支,它能通过细胞外刺激诱导多种细胞凋亡的发生。然而关于PD-L1蛋白表达与JNK信号通路的关系的研究资料甚少。鉴于以上证据,本课题以体外培养脐静脉内皮细胞作为研究对象,利用炎症因子(LPS)刺激脐静脉内皮细胞模拟病原微生物入侵的模型,观察脐静脉内皮细胞PD-L1表型的变化；再以JNK蛋白特异性抑制剂SP600125阻断JNK通路,探讨脐静脉内皮细胞表达PD-L1与JNK信号通路的关系,阐明LPS诱导脐静脉内皮细胞表达PD-L1蛋白的分子机制,完善负性协同刺激信号(PD-1、PD-L)调控T淋巴细胞活性的机理,有望为动脉粥样硬化的免疫治疗的提供新的思路及理论基础。目的1.LPS能否诱导脐静脉内皮细胞表达PD-L1。2.以JNK蛋白特异性抑制剂SP600125阻断JNK信号通路后,观察树突状细胞受炎症因子刺激后PD-L1表型变化,探讨树突状细胞表达PD-L1与JNK信号通路的关系。对象和方法1、对象体外培人脐静脉内皮细胞。2、方法2、1脐静脉内皮细胞的分离、鉴定及传代培养无菌条件下,取健康产妇剖腹产后新鲜的胎儿脐带,磷酸缓冲盐溶液(PBS)缓冲液清洗,用I型胶原酶消化、离心,加入含20%胎牛血清的M199培养液,放入5%C02培养箱内中37℃培养。24h后换液,待细胞生长达铺满瓶底80%-90%,以0.125%胰蛋白酶消化后传代培养,并在倒置显微镜下观察细胞的形态,选择生长良好的第4～5代细胞用于实验。采用形态学和内皮细胞Ⅷ相关抗原进行鉴定。原代的细胞一般培养4-5天后细胞可长满培养瓶底95%以上,显微镜下观察细胞融合成单层呈铺路石状,此时可传代。弃去培养瓶中旧培养液,用PBS(37℃预热20分钟)洗涤2-3次,加入1ml0.125%的胰蛋白酶(37℃预热20分钟)室温消化细胞20s,显微镜下观察细胞皱缩变圆、彼此分离即可将胰蛋白酶吸出,然后加入M199完全培养液终止消化,吸管轻柔吹打至均匀细胞悬液,按1：2传代培养。2.2程序降温法冻存内皮细胞,快速融化法复苏细胞2.2.1内皮细胞的冻存用一次性吸管吸去培养瓶中废弃的培养液,再用PBS洗涤细胞2次。以0.125%胰酶消化20秒,显微镜下观察细胞变圆、皱缩。用一次性吸管吸出胰酶,冻存液加入培养瓶中终止消化。弯头吸管吹打瓶中细胞数分钟,显微镜下观察细胞全部脱落。再将细胞悬液加入冻存管中,标记日期、细胞种类,封口胶封口。细胞程序降温：4℃冰箱20分钟→-20℃冰箱1小时→-70℃冰箱过夜→次晨投入液氮罐。2.2.2内皮细胞的复苏用镊子从液氮罐中取出标记内皮细胞的冻存管,将其迅速放入37℃水浴箱中充分摇晃至冻存管中细胞完全解冻(大约1分钟)。用酒精擦拭冻存管后入超净工作台。在15m1离心管中预先加入3倍冻存细胞体积的M199完全培养基,用一次性吸管将细胞液吸出加入离心管中混匀。低速离心：300rpm离心5分钟或500rpm离心3分钟。去上清,加培养液培养。将培养瓶置入孵箱中培养,待细胞长满后进行传代。2.3实验分组(每组设3个复孔,重复实验4次)收获第五代脐静脉内皮细胞,调整细胞密度为2×107/ml,接种于6孔培养板中。根据是否使用LPS和JNK蛋白特异性抑制剂SP600125将实验分成三组：阴性对照组、LPS组和SP600125+LPS组(LPS及SB203580均用二甲基亚砜(DMSO)溶解)第一组为阴性对照组(NORMAL):将未加入任何药物的细胞继续培养24小时作为阴性对照。第二组为LPS刺激组(LPS)：首先在实验细胞中加入DMSO (0.1%V/V)作用1小时,再加入LPS (1.0μg/ml)继续培养24小时(LPS每12h半量换液)；第三组为SP600125+LPS共刺激组：首先在实验细胞中加入SP600125(20μmol/L)作用1h后再用LPS刺激24h(LPS每12h半量换液)。2.4Western blot检测PD-L1蛋白自6孔培养板中提取人脐静脉内皮细胞,用RIPA细胞裂解液抽提全细胞蛋白样品,并经BCA法测定蛋白质浓度,SDS-PAGE电泳分离蛋白后转移到PVDF膜上,5%的脱脂奶粉封闭2h,加入抗PD-L1多克隆抗体,4℃孵育过夜,PBS洗膜后加入二抗,37℃孵育2h后ECL发光,暗室中曝光、显影、定影。Quantity One凝胶软件分析系统分析蛋白条带的光密度值。2.5Western blot检测P-JNK、JNK蛋白自6孔培养板中提取人脐静脉内皮细胞,用RIPA细胞裂解液抽提全细胞蛋白样品,并经BCA法测定蛋白质浓度,SDS-PAGE电泳分离蛋白后转移到PVDF膜上,5%的脱脂奶粉封闭2h,加入抗p-JNK多克隆抗体和抗JNK多克隆抗体,4℃孵育过夜,PBS洗膜后加入.抗,37℃孵育2h后ECL发光,暗室中曝光、显影、定影。Quantity One凝胶软件分析系统分析蛋白条带的光密度值,以p-JNK/JNK蛋白光密度的比值代表p-JNK的光密度值,分别算出阴性对照组、LPS组、SP600125+LPS组光密度的比值。3.统计学方法所有数据采用SPSS13.0软件处理,计量数据以均数±标准差(x±S)表示,统计学分析多样本比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),多重比较采用SNK-q检验,P<0.05认为差异有统计学意义。4.结果4.1MTT检测HUVECs增殖各组脐静脉内皮细胞OD值测定。阴性对照组OD值为0.32±0.003,LPS组0D值为0.34±0.033,SP600125+LPS组OD值为0.31±0.018,各组OD值比较P>0.05,各组细胞增殖无显著差异。4.2Western blot检测PD-L1蛋白Western blot曝光灰度扫描结果(Z值)显示,LPS组为1.12±0.72,SP600125+LPS组为0.66±0.36,对照组为0.59±0.30。SP600125+LPS组与对照组Z值均小于LPS组(P<0.05或P<0.05),SP600125+LPS组Z值与阴性对照组无显著差异(P>0.05)。4.3Western blot检测JNK、P-JNK蛋白Western blot曝光灰度扫描结果(Z值)显示,LPS组为1.26±0.09,SP600125+LPS组为0.49±0.18,对照组为0.95±0.21。SP600125+LPS组Z值均小于其它2组(P<0.05或P<0.05),LPS组Z值显著大于对照组(P<0.05)。5结论1、LPS可以诱导脐静脉内皮细胞PD-L1表达增高；2、JNK信号通路可能参与调控脐静脉内皮细胞表达PD-L1。