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MicroRNAs (miRNA)是一类小内源非编码RNAs分子,长度为19-24nt,在真核生物基因组中广泛存在。目前的研究表明,miRNAs在转录和转录后水平起着重要的作用。miRNAs通过与靶基因的序列互补以裂解或转录抑制的方式调控靶基因的表达。miRNAs在植物的多种生物和代谢途径中起着至关重要的作用,如叶片形态和分化、花器官的识别和分化、器官发育、细胞信号途径、生物和非生物胁迫等。桃起源于我国的西部地区,在世界上分布范围广泛,是一种重要的经济果树。随着分子生物学的发展,大量的桃EST序列已被释放并且桃品种’Lovell’的全基因组序列已于2010年4月公布(http://www.rosaceae.org/peach/genome)。这些资源为我们开展桃miRNA相关的研究提供了基础。为了解桃中miRNA的存在情况及其在整个生长发育过程中的作用,本研究以桃栽培品种‘良姬’为实验材料,利用生物信息学并结合miR-RACE、 qRT-PCR、PPM-、RLM-RACE等实验技术对桃中的miRNA进行了识别验证并对miRNA与靶基因的作用模式进行了相关分析。利用生物信息学方法,我们从桃的80,857条EST序列中预测了属于7个ppe-miRNA家族的22个潜在的miRNA序列。通过3’、5’miR-RACE和直接克隆技术,我们确定了8条候选miRNA的精确序列,尤其是确定了miRNA两端的序列。试验结果表明8条niRNA序列中除ppe-miR171b之外的其他7条miRNA的精确序列与生物信息学预测的序列一致。本实验验证了miR171家族中属于不同前体的两个成员(ppe-miR171a和miR171b)的存在。我们进一步用qRT-PCR技术分析了8个验证的miRNA在桃不同发育阶段的叶片、花和果实中的表达,结果发现这些miRNA均具有组织特异性空间表达。利用生物信息学方法,我们从已经公布的桃基因组序列中预测了属于70个miRNAs家族的262个潜在的miRNAs,并用3’和5’miRNAs快速扩增cDNA PCR反应和序列克隆方法验证了61个家族中的97个miRNAs的61条序列。验证miRNAs的末端序列可以特异的确定桃基因组中ppe-miRNAs的真实序列。通过比较预测和验证的ppe-miRNAs序列发现,验证的61条序列中有43条序列和预测的序列完全一致,余下的18条序列与预测的序列在两端位置表现出一定的差异。我们进一步用qRT-PCR分析了61条ppe-miRNAs在桃不同发育阶段的叶片、花和果实中的空间表达情况,结果显示61条ppe-miRNAs在不同的组织和发育阶段中表现出特异性的表达。为进一步研究ppe-miRNA在桃生长发育过程中的作用,我们预测了桃中miRNA对应存在的大量靶基因,并对部分预测靶基因的真实性以及ppe-miRNA与其靶基因之间的作用机制进行了研究。本研究克隆验证了9条靶基因的ORF序列,并通过利用本实验室开发的PPM-、RLM-RACE技术以及qRT-PCR方法对桃中7个miRNAs对应的9条的靶基因之间的靶作用模式进行了实验分析。研究结果证明,7个ppe-miRNAs是通过介导所靶向9条靶基因的裂解负调控其表达的,且PPM-、 RLM-RACE结果显示9条靶基因均在miRNA 5’端的第10位碱基处存在裂解位点。qRT-PCR结果发现ppe-miRNA与其靶基因在不同组织中的表达呈相反的趋势,靶基因两端裂解产物在不同组织中的表达与对应的ppe-miRNA的表达趋势一致而与靶基因的表达趋势相反,这一结果进一步确认了桃中]miRNA与其靶基因的裂解作用模式。实验发现miRNA靶向的靶基因参与植物的多种生长发育过程,因此验证预测靶基因的真实性以及了解miRNA与其靶基因的作用机制对于我们了解植物的生命过程有着重要的意义。