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骨骼肌的生长发育是一个十分复杂的生物学过程,大量研究表明MSTN可以负向调控肌细胞的生长发育。目前,对MSTN调控肌肉发育的机制研究大多集中在MSTN与靶蛋白间的互作关系,因此,获得其他作用机制有助于进一步了解MSTN调控肌肉发育的过程。1.采用Label Free结合LS-MS/MS技术对MSTN-/-鲁西牛和野生型鲁西牛的肌肉进行泛素化定量蛋白组学分析,共鉴定到135个泛素化肽段,归属于66个蛋白。与野生型牛相比,MSTN-/-牛中显著差异的泛素化肽段共17个,归属于17个蛋白质,其中4个上调,13个下调。生物信息学分析发现泛素化差异蛋白显著富集于肌肉生长发育、能量代谢和泛素蛋白水解等过程,STRING分析结果表明,泛素化差异蛋白主要富集在肌肉生长发育过程中。由于泛素蛋白水解系统可能在MSTN介导的肌肉发育过程中发挥重要作用,而泛素激活酶和泛素结合酶在泛素蛋白水解系统中发挥关键作用,所以结合肌肉萎缩、发育相关的参考文献,选择鉴定到的泛素激活酶UBA1,泛素结合酶UBE2L3和筛选到的泛素化差异蛋白泛素结合酶UBE2N,同时选择MRFs家族的生肌调节因子Myo D1和Myo G,与MSTN共同进行STRING蛋白互作分析,结果发现UBA1、UBE2N、UBE2L3、Myo D1、Myo G均和MSTN具有互作关系。初步推测MSTN可能通过泛素化途径中关键的泛素化酶,进而发挥对牛肌肉发育分化的调控作用。2.由于肌卫星细胞的体外成肌分化过程可以很好地模拟体内的发育过程,为了研究MSTN对牛肌肉发育分化的影响,后续试验均利用实验室已建立的牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型。首先利用si-MSTN成功构建了牛骨骼肌卫星细胞MSTN抑制表达模型,采用Ed U细胞增殖实验检测牛骨骼肌卫星细胞中的Ed U阳性细胞数,研究MSTN对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响。通过q RT-PCR和Western blot检测牛骨骼肌卫星细胞分化标志因子My HC的m RNA和蛋白表达水平,同时采用免疫荧光技术进一步检测牛骨骼肌卫星细胞的肌管形成状态,研究MSTN对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的影响。发现干扰MSTN表达可以促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖,促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化。3.进一步研究MSTN与泛素蛋白酶体途径之间的关系。首先利用第二章建立的MSTN抑制表达模型,通过Western blot检测牛骨骼肌卫星细胞中蛋白质的泛素化水平,发现干扰MSTN表达可以促进牛骨骼肌卫星细胞中蛋白质的泛素化。筛选出了最适浓度为1.25μmol/L的蛋白酶体抑制剂MG132处理牛骨骼肌卫星细胞24 h,通过阻断蛋白酶体对泛素化蛋白的降解,从而升高牛骨骼肌卫星细胞中蛋白质的泛素化水平。采用Ed U细胞增殖实验检测牛骨骼肌卫星细胞中的Ed U阳性细胞数,通过Western blot检测牛骨骼肌卫星细胞分化标志因子My HC的蛋白表达水平,研究泛素化对牛骨骼肌卫星细胞增殖和成肌分化的影响,发现泛素化可以抑制牛骨骼肌卫星细胞的增殖,促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化。推测MSTN通过泛素蛋白酶体途径影响牛肌肉发育分化。4.泛素激活酶是泛素化酶联反应的起点,而泛素激活酶UBA1负责细胞内99%的泛素活化,同时UBA1是MSTN-/-牛肌肉泛素化蛋白组学分析中的泛素化修饰蛋白,第一章中推测MSTN可能通过泛素化途径中关键的泛素化酶,进而对牛肌肉发育分化发挥调控作用。所以本研究首先利用第二章建立的MSTN抑制表达模型,通过Western blot检测牛骨骼肌卫星细胞中UBA1的表达水平,发现干扰MSTN表达可以促进牛骨骼肌卫星细胞中UBA1的表达。进一步利用si-UBA1成功构建了牛骨骼肌卫星细胞UBA1抑制表达模型,通过干扰UBA1进一步分析MSTN通过泛素蛋白酶体途径对牛骨骼肌卫星细胞增殖和成肌分化的调控机制。采用Ed U细胞增殖实验检测牛骨骼肌卫星细胞中的Ed U阳性细胞数,研究UBA1对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响。通过q RT-PCR和Western blot检测牛骨骼肌卫星细胞生肌调节因子Myo D1和分化标志因子My HC的m RNA和蛋白表达水平,同时采用免疫荧光技术进一步检测牛骨骼肌卫星细胞的肌管形成状态,研究UBA1对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的影响。发现干扰UBA1表达可以下调Myo D1的表达,推测MSTN对牛成肌分化的影响是通过泛素蛋白酶体途径中的泛素激活酶UBA1,进而调控Myo D1的表达,而Myo D1表达水平的改变进一步调控了牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化进程。综上所述,本研究对MSTN-/-牛进行了泛素化蛋白组学分析,生物信息学分析发现泛素化差异蛋白与肌肉发育相关。利用牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型,发现干扰MSTN表达可以上调蛋白质的泛素化水平,而泛素化可以促进骨骼肌卫星细胞的分化;同时发现干扰MSTN表达可以上调UBA1的表达,而干扰UBA1表达可以下调Myo D1和My HC的表达,推测MSTN对牛成肌分化的影响是通过调控UBA1表达,进而调控Myo D1,Myo D1表达水平的改变进一步影响了牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化进程。