研究背景：　　 霍奇金淋巴瘤(Hodgkins lymphoma,HL)是一种好发于儿童和中青年的淋巴造血系统恶性肿瘤,具有非常独特的组织病理学特征,即少量的恶性成分H/RS(Hodgkin/Reed-Sternberg,H/RS)细胞存在于大量的背景细胞中。HL的发生发展机制一直成为学术界悬而未决的问题。　　 近年来关于H/RS细胞的研究取得了很大的进展,研究结果表明:H/RS细胞起源于生发中心凋亡前B细胞(残疾B淋巴细胞),κ基因结合核因子(NF-κB)被认为是H/RS细胞的存活因子。NF-κB属于一个高度保守的转录因子家族,作为重要的转录调控因子,可调节很多基因表达,这些基因与细胞增殖、分化、免疫反应、凋亡、转化有着密切关系。NF-κB在H/RS细胞中表现为持续活化,NF-κB的持续活化是H/RS细胞显著的分子特征,它能抑制H/RS细胞凋亡,促进其增殖,是调节B细胞分化和存活的重要转录因子。　　 H/RS细胞的产生还与人CD99的缺失有关。人CD99,即MIC2抗原(又称胸腺白血病抗原),是一个分子量为32kDa的糖基化跨膜蛋白,主要功能是参与血细胞分化过程中的细胞间黏附及细胞的凋亡等。YH等报道将反义CD99基因转染B淋巴细胞瘤株BJAB和IM9细胞使CD99表达缺失,显示出同HL患者淋巴瘤组织中类似的H/RS细胞的典型特征,出现“镜影细胞”,表达CD30和CD15；再将CD99基因转入上述类H/RS细胞中,该细胞又恢复到B淋巴细胞瘤原有的形态和表型特征,提示H/RS细胞的发生及免疫表型的变化与CD99基因表达缺失有关。　　 微小RNA(miRNAs)是人类新发现的一类非编码小分子RNA,是一类内源性RNA小分子,长约19-25个核苷酸。miRNA具有高度保守性、时序性、组织细胞特异性。miRNAs通过与靶基因互补位点配对结合,能在转录后水平调控基因的表达,主要作为基因表达的负性调控因子,在调节生物体的生长发育、细胞分化和凋亡及肿瘤的发生发展中起着非常重要的作用,近年来研究的热点。　　 人miR-9(hsa-miR-9)有23个核甘酸,在多种肿瘤发生发展中起着非常重要的作用。miR-9在经典型霍奇金淋巴瘤(classic Hodgkin lymphoma,cHL)细胞中表达情况又如何呢?国内尚未见报道,国外鲜见报道。本研究在课题组前期的基础上通过荧光定量PCR和原位杂交等方法探究miR-9在cHL中的表达情况,通过免疫组化、荧光定量PCR、免疫荧光共聚焦和Western blot等方法揭示miR-9与cHL形成有密切关系的CD99、NF-κB信号通路之间的相互调控关系,为进一步研究HL中H/RS细胞形成的分子机制奠定理论与实验基础。　　 本研究通过以下三部分进行:　　 第一章磁珠分选B细胞、B淋巴瘤细胞及cHL细胞miR-9表达差异及意义　　 1.目的:探究miR-9在磁珠分选的B淋巴细胞、B细胞淋巴瘤及cHL细胞株中的表达差异及其意义。　　 2.方法:应用CD19磁珠阳性分选正常淋巴结中B淋巴细胞,将分选出的CD19+B淋巴细胞和三株B细胞淋巴瘤(两株起源不同的弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株OCI-Ly1、OCI-Ly10,一株伯基特淋巴瘤细胞株Raji)细胞及cHL细胞株L428细胞,分别提取细胞总micro-RNA,逆转录成cDNA,荧光定量PCR检测miR-9的表达,原位杂交检测每株细胞miR-9的表达。　　 3.结果:miR-9在cHL细胞株L428中高表达(104.44±1.61),B细胞淋巴瘤细胞株中表达较低(OCI-Ly1:2.17±0.38；OCI-Ly10:1.00±0.016；Raji:2.65±0.89),CD19+B淋巴细胞表达极低(0.0025±0.00040),L428的miR-9表达量与其它细胞株相比,F=8942.137,P=0.000,差异均具有统计学意义;miR-9阳性定位于细胞质,在L428细胞胞质弥漫强阳性分布,OCI-Ly1、OCI-Ly10细胞少量散在细胞胞质弱阳性表达,有些细胞在核膜周围分布明显,Raji细胞少量散在细胞胞质弱阳性表达。　　 4.结论:miR-9在L428细胞中特异性高表达,有望作为cHL诊断与治疗的分子标记物。　　 第二章 CD99、NF-κB信号通路在cHL细胞株中的表达情况及其意义　　 1.目的:验证CD99、NF-κB信号通路在cHL中的表达情况及其意义。　　 2.方法:应用免疫细胞化学检测NF-κB P65和CD99在细胞株L428、上调CD99的L428细胞株L428-CD99细胞的表达情况；运用免疫荧光共聚焦、实时荧光定量PCR、Western Blot检测细胞株L428和L428-CD99中CD99的表达水平；运用免疫荧光共聚焦、Western Blot检测细胞株L428和L428-CD99中NF-κB P65的表达水平。MTT实验检测L428和L428-CD99细胞增殖能力的差异；流式细胞术检测L428和L428-CD99细胞的凋亡率差异。　　 3.结果:免疫细胞化学法显示:CD99表达定位于细胞膜,在L428细胞中为阴性表达,在L428-CD99中为弥漫阳性表达。NF-κB P65在L428中为弥漫强表达,表达定位于细胞核；在L428-CD99中为弥漫阳性表达,表达定位于细胞浆。免疫荧光共聚焦法显示CD99在L428细胞为阴性表达,在L428-CD99为细胞膜阳性表达。荧光定量PCR显示L428的CD99表达量为1.0243±0.2588,L428-CTR的CD99表达量为1.2408±0.6676,L428-CD99的CD99表达量为35.1382±2.6454。L428-CD99细胞株中的CD99表达量与其L428相比,F=285.824,P=0.007,L428-CD99细胞株中的CD99表达量与其L428-CTR相比,P=0.006,差异均具有统计学意义,而L428的CD99表达量与L428-CTR相比,P=0.930,差异不具有统计学意义。Western blot显示L428中CD99无表达,L428-CD99为阳性表达。NF-κB P65在L428和L428-CD99表达条带大小一致。MTT实验显示:不同细胞组之间差异具有显著性(F=427.671,P=0.000),上调CD99的L428的增殖能力低于L428(P=0.022)及L428-CTR(P=0.032),差异具有统计学意义,而L428和L428-CTR的增殖能力差异不具有统计学意义(P=0.995)。流式细胞术检测细胞凋亡率显示上调CD99的L428的凋亡率明显多于L428(t=-29.394,P=0.000),差异具有统计学意义。　　 4.结论:CD99在L428细胞表达缺失,而在细胞株L428-CD99中表达阳性,可用于后续研究。NF-κB P65在L428主要为细胞核表达,而在L428-CD99细胞株中为细胞浆表达,提示NF-κB信号通路在L428细胞为持续活化,而在L428-CD99细胞NF-κB信号通路失活。上调CD99可导致L428增殖能力减弱,细胞凋亡率增高。　　 第三章 miR-9、CD99、NF-κB信号通路在cHL细胞相互调控关系及机制的研究　　 1.目的:研究miR-9、CD99、NF-κB信号通路在cHL细胞的相互调控关系及其机制。　　 2.方法:应用瞬时转染技术将miR-9反义寡核苷酸探针片段转染至cHL细胞株L428细胞,构建下调miR-9瞬时转染细胞株L428-miR-9,应用NF-κB信号通路抑制剂BAY11-7082作用于L428细胞,构建NF-κB信号通路失活的细胞株L428-BAY。本课题组前期已成功构建了上调CD99稳定细胞株L428-CD99,而本研究则在上述细胞株L428和L428-CD99、L428-miR-9、L428-BAY的基础上,应用荧光定量PCR、免疫荧光共聚焦、核浆蛋白分离及Western Blot等方法验证CD99、miR-9及NF-κB信号通路之间的相互调控关系。MTT实验检测L428、L428-CTR、L428-CD99、L428-NC、L428-miR-9和L428-BAY细胞之间细胞增殖能力的差异；Hoechst33342/PI双染试剂盒检L428、L428-CD99、L428-miR-9和L428-BAY细胞凋亡的差异。　　 3.结果:L428-miR-9细胞和L428-BAY细胞构建成功。荧光定量PCR显示L428的CD99的表达量为1.0046±0.1154,L428-NC的CD99的表达量为0.9819±0.1812,L428-miR-9的CD99的表达量为0.9398±0.1550。L428细胞CD99的表达量和L428-NC(F=0.139,P=0.861)、L428-miR-9(F=0.139,P=0.622)细胞相比,差异不具有统计学意义。L428的CD99的表达量为1.0045±0.1152,L428-BAY的CD99的表达量为0.8273±0.0777。加入NF-κB抑制剂BAY11-7082后,CD99的表达量和L428相比,差异不具有统计学意义(t=2.207,P=0.092)。L428的miR-9的表达量为27.4177±7.4522,L428-CTR的miR-9的表达量为27.5640±8.7422,L428-CD99的miR-9的表达量为1.0365±0.3382。上调CD99后miR-9的表达量和L428细胞(F=16.910,P=0.002)及无义寡核甘氨酸L428-CTR细胞(F=16.910,P=0.002)相比,差异具有统计学意义。L428的miR-9的表达量为1.0265±0.2807,L428-BAY的miR-9的表达量为0.9054±0.2307。加入NF-κB抑制剂BAY11-7082后,miR-9的表达量和L428相比,差异不具有统计学意义(t=0.577,P=0.595)。Western blot显示L428、L428-CTR、L428-CD99、L428-miR-9、L428-BAY细胞株中全蛋白的表达水平恒定,而CD99仅在L428-CD99细胞株中有表达,在L428、L428-CTR、L428-miR-9、L428-BAY均无表达。IκB alpha在细胞株L428-miR-9、L428-BAY表达,在L428、L428-CTR无表达,在L428-CD99为极弱表达。经核浆蛋白分离后,L428、L428-CTR细胞株中核蛋白的P65表达水平高,L428-miR-9中P65表达水平较低,L428-CD99、L428-BAY表达水平极低。L428、L428-CTR细胞株中浆蛋白的P65表达水平极低,在L428-miR-9中P65表达水平较高,在L428-CD99、L428-BAY表达水平极高。MTT实验显示不同细胞组之间差异具有显著性(F=559.898,P=0.000),L428的增殖能力强于细胞株L428-CD99细胞(P=0.022)和L428-BAY细胞(P=0.000),差异具有统计学意义；L428的增殖能力与L428-CTR细胞(P=1.000)、L428-NC细胞(P=1.000)、L428-miR-9细胞(P=1.000)相比,差异不具有统计学意义。Hoechst33342/PI双染试剂盒检测凋亡显示L428的细胞凋亡少于L428-CTR、L428-CD99、L428-miR-9、L428-BAY的细胞凋亡。　　 4.结论:CD99可负性调控NF-κB信号通路及miR-9,miR-9可正性调控NF-κB信号通路。CD99和NF-κB活性被抑制可导致L428细胞增殖能力下降,细胞凋亡率增高。而miR-9下调对L428细胞增殖能力并无影响,但能引起细胞凋亡率增高。　　 创新之处：　　 1.首次采用原位杂交技术直观显示miRNA-9的空间定位。　　 2.首次比较完整地阐述了HL细胞中CD99、miR-9和NF-κB信号通路的相互调控关系。