【摘 要】
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猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是危害我国养猪业的头号元凶,给我国养猪业造成巨大的经济损失。现如今,虽然疫苗的使
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猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是危害我国养猪业的头号元凶,给我国养猪业造成巨大的经济损失。现如今,虽然疫苗的使用使得PRRSV感染引发的爆发流行得以控制,但在临床上PRRSV与细菌等微生物共感染的现象非常普遍。然而,到目前为止,其具体的机制还不清楚。在肺部,猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAM)是PRRSV感染的靶细胞。已有的研究显示,PRRSV感染可破坏PAM介导的先天性免疫防御包括对入侵病原菌的吞噬。巨噬细胞A类清道夫受体(Scavenger Receptor,SR)如SRA和MARCO,作为一类重要的先天性免疫受体,介导对多种病原菌的识别和吞噬,包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等。我们前期的研究显示猪SRA和MARCO可以介导对临床常见分离菌如金黄色葡萄球菌、副猪嗜血杆菌等的吞噬。进一步,我们的前期结果显示PRRSV感染下调SRA和MARCO在PAM上的表达(mRNA水平)。因此,这些结果促使我们假想:PRRSV感染可通过下调清道夫受体SRA和MARCO的表达抑制细菌的吞噬,从而促进细菌的继发感染。本研究聚焦于PRRSV感染下调清道夫受体表达机制研究,具体如下:首先,利用Western blot方法对猪不同组织中SRA和MARCO的表达情况进行了分析。在肺中,我们可以检测到SRA和MARCO的表达。但在PAM上SRA有较高水平的表达,MARCO的表达量较低,几乎检测不到其表达。随后,我们对PRRSV感染下调清道夫受体表达机制进行了研究。鉴于MARCO在PAMs细胞上低水平表达,因此,我们主要聚焦于PRRSV感染下调SRA表达的机制研究。具体的研究结果为:1)我们收取PRRSV感染的PAM不同时间点的mRNA和蛋白样品进行分析,结果显示PRRSV感染可通过抑制转录下调SRA的表达。2)利用UV灭活的病毒作为对照,我们的研究显示PRRSV感染下调SRA的表达与病毒复制相关。3)我们克隆了猪的SRA的启动子并构建表达虫荧光素酶的报告质粒,通过测定luciferase验证SRA启动子的有活性;进一步,通过缺失突变,鉴定出核心启动子区域。利用双荧光素酶报告基因检测技术,筛选到PRRSV的非结构蛋白NSP4可以抑制SRA的荧光素酶活性。进一步,我们的研究发现NSP4主要抑制其核心启动子的活性。4)通过染色质免疫共沉淀方法(CHIP)验证NSP4与猪SRA启动子的相互作用,我们的研究结果发现NSP4可以与猪SRA启动子直接结合,其主要结合部位在-84到-214位置。
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