东方粘虫Pseudaletia separata(Walker)是我国和其它亚洲国家粮食作物的主要害虫之一,广泛分布于我国各地。东方粘虫具有迁飞性、暴食性等特点,容易暴发成灾。我国科学家曾对其宏观迁飞规律、迁飞行为机制、飞行与生殖的关系等进行了深入研究,但对其种群分子遗传学却很少涉及。本研究着力于东方粘虫微卫星标记的分离和鉴定,为以后种群遗传学研究准备工具；同时,本研究对该物种基因组微卫星特征和变异进行了较深入地分析,并优化了鳞翅目成虫DNA提取的技术方法。将传统的蛋白酶K+SDS+苯酚抽提方法和CTAB方法结合起来,筛选出从东方粘虫成虫自然种群的乙醇保存标本中提取高质量、高产量基因组DNA的方法,用于制备分离微卫星标记所需的DNA样品。对比研究结果表明,用CTAB+传统方法提取DNA时,取腹部中段10-20 mg组织样品进行实验,不同种群DNA产品合格率68.42%-95.28%,提取合格DNA量5.59-10.04 mg/g,显著高于传统蛋白酶K+SDS裂解及苯酚抽提方法的7.69%-40%和2.83-5.78 mg/g。另外,用热NaOH法快速制备用于大规模基因分型的DNA样品的研究结果表明,对于胸部和腹部组织样品,用热NaOH溶液处理20 min,就能够提取出微卫星PCR扩增反应所需的DNA样品；对于头部组织样品,用热NaOH溶液处理40-60 min是比较合适的。对比研究结果显示,来自热NaOH方法的DNA样品在构建微卫星富集文库过程中失败,但两种样品作为模板进行微卫星PCR扩增的产物在遗传分析仪上检测结果相同。利用生物素5’标记的(CA)15、(GA)15、(ATG)12、(GAT)12、(TAGA)8和(GTGA)8作为探针,采用磁珠富集法构建东方粘虫微卫星富集文库。经过基因组DNA酶切、300-700bp片段回收、连接接头、纯化、连接产物变性、已结合探针的磁珠捕捉目标片段、目标片段洗脱、PCR扩增、连接pGEM-T载体并转化DH5α高效感受态细胞、蓝白筛选等过程,最后构建成功包含8531个克隆的粘虫微卫星富集文库。从文库随机抽取866个克隆进行测序,并分析序列中是否含有微卫星,统计结果表明,所建文库中平均微卫星阳性克隆率35.8%,高于以往对棉铃虫、马尾松毛虫等鳞翅目昆虫进行同类研究的结果。用REPEATMASKER软件和人工分析相结合,对本研究已筛选出的一批东方粘虫微卫星的类型、各类丰度、变异情况等进行深入分析,并与InSatDb数据库中5种全基因组测序昆虫(黑腹果蝇、冈比亚按蚊、赤拟谷盗、意大利蜜蜂、家蚕)基因组中微卫星的特征和变异情况进行比较。本研究已发现369个东方粘虫微卫星序列、46个低复杂度区域、6个转座元件和1个tRNA.所得微卫星分属于21个不同重复基序,以TTG/CAA基序的微卫星最多,占全部微卫星总数的37.13%,其次是CA/TG类和CAT/ATG类,分别占30.89%和15.72%。这三类微卫星合起来占全部微卫星的83.74%。所得微卫星序列还具有短型偏多、不完全型(存在突变)偏多、AT富集的偏多、复合型较少等特点。这些特点与5种全基因组测序昆虫微卫星的统计结果基本一致。对不完全型微卫星的重复序列变异情况进行统计,替换碱基比例一般0.6%-11.7%,个别达到15.6%-26.1%；缺失碱基比例0.5%-10.6%,插入碱基比例0.3%-11.3%,平均每处插入／缺失碱基1-1.8,个别达到3-6个碱基。进一步的分析发现,东方粘虫微卫星重复序列的变异还存在如下特点：碱基替换在突变中占据优势,在全部微卫星基因座中发生比例达到92.38%,而缺失和插入微卫星比例分别只有27.62%和25.24%；替换+插入、替换+缺失的发生比例接近,均为20%稍多,而缺失+插入、替换+缺失+插入的比例较低,均为12%稍多；两类数量最多的微卫星TTG/CAA(137个)、TG/CA (114个)的重复序列变异中,转换和颠换发生的频率并不相同,转换要多于颠换；重复序列长度101-150bp和151-200bp的微卫星发生变异的概率较大,变异碱基数较多,而小于50bp和大于200bp的微卫星变异比例和碱基变异比例均明显减小；TTG/CAA类的变异微卫星比例高于TG/CA类,而变异碱基比例则明显低于后者；变异微卫星重复序列近5’端(将一个重复序列分为五段,即5’端、近5’端、中段、近3’端、3’端)变异碱基数最多,其次是中段,而两极则相对较少发生变异,而且变异最多区域出现在近5’端的微卫星数量也最多。另外,在各类微卫星基因座侧翼序列比较中,仅发现11类侧翼序列相同的多拷贝微卫星基因座,涉及微卫星基因座24个,占所发现全部微卫星基因座的6.50%。但并没有发现侧翼序列高度相似的微卫星家族。在含有微卫星的克隆序列中,经过序列选择、引物设计和合成、Touchdown PCR初选(24个基因组DNA样品)、优化PCR优选(24个基因组DNA样品)、遗传分析仪再选(48个基因组DNA样品)等三轮筛选,共筛出8个多态性微卫星标记(GenBank登录号FJ896055-FJ896062).对8个微卫星基因座在48个样品中的等位基因分布情况进行统计,并用GenePop软件进行检测,经Bonferroni校正,均符合哈迪-温伯格平衡(Hardy-Weinberg proportions),微卫星基因座之间也没有检测出显著的配子相不平衡(gametic phase disequilibrium)。用Cervus软件统计计算,各基因座有11-31个等位基因,期望杂合度0.747-0.931,显示出各基因座都具较好多态性,可用做东方粘虫种群研究的遗传标记。本研究的创新之处主要表现在以下几个方面：一、改进了鳞翅目成虫基因组DNA提取方法,使之适合微卫星富集文库构建、微卫星标记筛选和分型的需要；二、国内首次成功构建东方粘虫微卫星富集文库,抽样检测微卫星阳性克隆率较高；三、首次对东方粘虫基因组微卫星序列进行特征和变异分析,丰富了鳞翅目昆虫基因组微卫星序列的信息；四、首次筛选出8个东方粘虫微卫星标记,填补了东方粘虫微卫星遗传标记的空白。