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脂肪性状作为绵羊肉品质最重要的一个经济性状,在绵羊体内维持着正常生命活动以及在生理代谢中发挥着重要的作用。作为含量最高、唯一与肥胖呈负相关的脂肪细胞因子,脂联素在体内参与调节脂肪与糖代谢、维持能量平衡及抵抗胰岛素、抗消炎反应等生理过程。目前,有关绵羊脂联素及其受体基因在脂肪分化过程中作用的报道较少。本研究以兰州大尾羊为研究对象,利用RACE技术首次克隆了绵羊脂联素及其受体基因的全长c DNA序列,运用实时荧光定量PCR技术(q PCR)分析了绵羊脂联素基因、脂联素受体1和脂联素受体2基因在绵羊15种组织的表达规律;分离培养绵羊肌内、皮下和内脏组织的前脂肪细胞,研究了前体脂肪细胞在分化过程中脂联素及其受体、生脂基因脂蛋白脂肪酶(LPL)、激素敏感性脂肪酶(HSL)、脂肪酸合成酶(FAS)及过氧化物激活酶增值物受体α/γ(PPARα/γ)的表达;运用过表达和si RNA技术分析了脂联素受体对肌内前体脂肪细胞生脂的影响及相关生脂基因表达影响;应用pull-down技术和质谱分析,初步筛选出了与脂联素受体蛋白互作的蛋白,以期阐明绵羊脂联素及其受体介导绵羊肌内、内脏和皮下脂肪细胞生脂基因表达与分子调控机理,为现代肉羊育种体系中优良性状的筛选与利用提供理论依据。研究结果表明:1.应用RACE技术首次克隆出绵羊脂联素2010bp(KJ159213)、脂联素受体1基因2035bp(KJ159212)和脂联素受体2基因1809bp(KF921623)全长c DNA;q PCR研究了三种基因在绵羊肝脏、肾脏、心脏、肺脏、脾脏、皮下脂肪、内脏脂肪、肌肉、卵巢、睾丸、大肠、小肠、间脑、瘤胃和皱胃15种组织中的特异性表达,APN肌肉组织中表达最高,心脏和皱胃表达量次之;Adipo R1在皮下组织和内脏脂肪组织中的表达量最高,其次是脾脏、心脏、小肠;Adipo R2在皮下组织和内脏组织中表达量最高,在其他组织中表达量均很低,几乎不表达。2.应用Ⅰ型胶原酶消化法分离获得绵羊肝脏和皮下组织前体脂肪细胞,并用DMEM/F12+胰岛素(5μg/m L)+转铁蛋白(50μg/m L)+亚硒酸钠(5ng/m L)+氢化可的松(50ng/m L)将其诱导11天后能分化为内脏和皮下脂肪细胞;应用II型胶原酶消化法和差速贴壁法分离获得绵羊背最长肌肌内前体脂肪细胞,被DMEM/F12+IBMX(0.5 mmol/L)+DEX(1μmol/L)+Insulin(10 mg/L)诱导10 d后分化为肌内脂肪细胞。3种前体脂肪细胞分化过程中脂肪生成量逐渐增加,生长曲线均呈“S”型,第3~9 d为指数生长期。绵羊内脏和皮下前体脂肪细胞中LPL和PPARγ分化第7d和11d显著高于第3d(p<0.05),FAS基因第7天最高;脂联素及其受体基因在两种细胞中的表达水平差异不显著(p>0.05),但三个基因之间Adipo R2表达量最高(35.27),Adipo R1居中(5.24),APN最低(0.60)。类似地,绵羊肌内脂肪细胞中Adipo R2表达量极显著高于Adipo R1和APN(p<0.01),表达趋势也与3基因在内脏脂肪组织和皮下脂肪组织中相类似,但表达水平有所下降。LPL、PPARγ和FAS在肌内前体脂肪细胞诱导分化过程中的表达模式与内脏和皮下前体脂肪细胞相一致,表明Adipo Rs、LPL和PPARγ是脂肪细胞分化的早期标记基因。3.Adipo R1在绵羊肌内前体脂肪细胞分化过程中,能通过调节激素敏感性脂肪酶(HSL)和过氧化物激活酶增值物受体γ(PPARγ)表达在脂肪生成中起重要作用。(1)诱导分化后第7天,肌内前体脂肪细胞中的HSL和Adipo R1的m RNA表达水平降低,其余标志基因的m RNA表达增加,但对Adipo R2表达无显著影响;(2)过表达Adipo R1可显著降低肌肉前体脂肪细胞沉积,过表达Adipo R2对其脂肪沉积无显著影响。过表达Adipo R1后可增加HSL的表达,降低PPARγ表达,不影响FAS和PPARα的表达,而Adipo R2基因过表达后,对HSL、FAS、PPARα和PPARγ表达没有影响;(3)Adipo R1基因沉默,肌内前体脂肪细胞的体积增大,脂肪沉积含量增加,极显著地降低肌内前体脂肪细胞中HSL的表达,增加PPARγ表达,对FAS和PPARα表达无影响;Adipo R2基因沉默后,对肌内前体脂肪细胞体积与脂肪沉积含量没有显著影响,同时对HSL、FAS、PPARα和PPARγ表达也无影响;4.运用Pull-down技术和质谱分析表明,在绵羊内脏脂肪中L-乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase)和1-型长链脂酰辅酶A合成酶(Acyl-Co A synthetase long chain family member-1)能与Adipo R1互作;尾部脂肪中1-型长链脂酰辅酶A合成酶(Acyl-Co A synthetase long chain family member-1)能与Adipo R2互作,为进一步研究脂联素受体功能奠定了基础。综上所述,综上所述,Adipo R1在绵羊肌内前体脂肪细胞分化过程中,通过调节激素敏感性脂肪酶(HSL)和过氧化物激活酶增值物受体γ(PPARγ)的表达在脂肪生成中起重要作用,可作为重要遗传标记基因应用肉羊育种实践。