核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)是一种破坏力极强的致病真菌,引起菌核病,导致严重的经济损失,是农业生产上迫切需要解决的重要问题。目前对植物抗核盘菌的分子机制的研究还不够深入。为增进对植物抗核盘菌的分子机制的理解,为抗菌核病分子育种提供潜在的有利基因资源,本研究以模式植物拟南芥为研究材料,分析了WRKY家族和AGO1对核盘菌的抗性调控功能,获得了以下主要结果：(1)采用生物信息学技术预测分析了拟南芥AGO蛋白家族的细胞定位,明确了AtAG02的亚细胞定位。十个拟南芥AGO蛋白均不含信号肽序列,表明它们不是外泌蛋白。AtAGO1, AtAGO2, AtAGO3, AtAGO4和AtAGO9均带有核定位信号,但携带的核定位信号肽序列各不相同,显示这些AGO蛋白可能定位于细胞核。克隆了AtAGO2全长序列,构建获得与报告基因eGFP融合表达的细胞定位检测载体pCHF3-eGFP::AtAGO2,采用农杆菌介导的方法将其瞬时表达于本氏烟叶片中,激光共聚焦观察结果表明,AtAGO2蛋白定位于细胞质和细胞核中。茉莉酸处理诱导AtAGO2蛋白在细胞质膜及其周围“颗粒化”聚集,但抗病诱导剂BTH处理不影响AtAGO2蛋白的亚细胞定位。(2)获得了AtAGO1的超表达转基因拟南芥纯合株系,并利用超表达转基因植株和突变体植株揭示了AtAGO1基因对核盘菌抗性的重要调控作用。本研究构建了过量表达载体35S::AtAGO1,并利用根癌农杆菌介导的花序浸蘸法导入拟南芥中,获得35S::AtAGO1单拷贝株系,转代获得纯合拟南芥AGO1超表达植株(AtAGO1-OE)。通过实时荧光定量PCR检测各株系中AGO1基因表达情况,结果显示基因表达各异,表达量高的为对照野生型5倍多,表达量较低的约为1-2倍,也有表达量受抑制的,仅为对照的0.15倍左右。利用突变体及超表达植株,分析了AGO1对核盘菌抗性的调控作用。与野生型相比,突变体agol-27病斑较大,病害症状严重,而AGO1高表达的转基因株系发病减轻。对超表达转基因植株接种核盘菌前后体内防卫基因表达的分析结果显示,AtAGO1-OE植株中PR1、PAD4、RD22组成性表达水平高于野生型。接种核盘菌后,野生型植株中PR5基因早期下调,其它五个基因(PR1、PAD4、 GST、DFF1、2、RD22)表达上调；AtAGO1-OE植株中所有六个基因表达均显著增加,而且增加幅度明显大于野生型；突变体植株中PAD4和PR5分别在早期和后期下调,PR1和RD22后期大幅上调,GST和PDF1.2则接种后持续上调,但幅度小于AtAGO1-OE植株。这些结果表明,AGO1可能通过不同方式活化各相关途径,从而调控拟南芥对核盘菌的抗性。(3)利用拟南芥突变体,分析了WRKY家族对核盘菌抗性的调控功能.接种核盘菌后,WRKY6.WRKY8和WRKY11基因表达量显著上调。与野生型植株相比,接种核盘菌后wrky6和srky8拟南芥突变体的病害症状显著加重,而wrky69和wrky70突变体则减轻。Trypan Blue染色结果显示,与野生型对照相比,接种后,wrky6.wrky8突变体中菌丝生长较快,量大,wrky70较慢,量少。DAB染色结果表明,接种后的wrky6、wrky8突变体叶片细胞中H2O2积累比野生型植株多。防卫基因表达分析结果显示,与野生型相比,wrky6和wrky8突变体中NPR1表达量下调,PR5表达量则上调,而wrky69和wrky70突变体中这两个基因以及PAD4均强烈上调。接种后,wrky70突变体中所有五个基因(PR1、PR5、PAD4、 NPR1、PDF1、2)表达均强烈上调,wrky69突变体中PR1基因小幅上调,其余四个基因表达均强烈上调,而wrky6和srky8突变体中这些基因要么下调(PR5、PAD4),要么上调幅度低于野生型植株,更远远低于wrky69和wrky70(PR1、 NPR1.PDF1.2)。这些结果揭示,WRKY6和WRKY8正调控、而WRKY69和WRKY70负调控拟南芥对核盘菌的抗性。这些WRKy基因可能通过激活多条途径实行其抗核盘菌调控功能。