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多项研究表明,乙型淀粉样蛋白(amyloid beta protein, Abeta)在脑内的大量产生并堆积是导致阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s desease, AD)发生的首要原因。在未来AD的诊断和治疗领域中,Abeta可能会扮演更为重要的角色。论文首先利用重叠PCR技术克隆出人的乙型淀粉样蛋白基因并成功构建出原核表达质粒pGEX-Abeta;转化大肠杆菌DH5α后,优化目的融合蛋白GST-Abeta的各项摇瓶发酵条件;最后采用亲和色谱直接纯化出目的融合蛋白GST-Abeta。结果如下: 1、原核表达质粒pGEX/Abeta的构建 根据Genbank提供的人Abeta氨基酸序列,人工合成了两对PCR引物。采用重叠PCR方法获得全长人Abeta基因片段后,利用T-A原理将扩增的外源目的片段插入TOPO-TA2.1克隆载体,转化大肠杆菌DH5α并提取质粒DNA。经PCR、酶切、序列分析等多步鉴定,确认克隆的基因片段为人Abeta基因后亚克隆入表达载体pGEX-6p-1进行表达。SDS-PAGE凝胶29KD处的蛋白条带经Western-blotting检测证实其为目的蛋白。 2、GST-Abeta摇瓶发酵工艺的研究 通过摇瓶发酵对大肠杆菌DH5α生产GST-Abeta的诱导温度、诱导时机、诱导表达时间等培养条件进行了优化,同时也对发酵液的接种量、摇床转速等工艺条件进行了研究。结果表明,摇床转速控制在200rpm左右,在菌液对数生长前期加入终浓度为0.5mM的IPTG,30℃条件下诱导4小时后,即可获得较高的表达量。薄层扫描结果显示GST-Abeta表达量为24.3%。 3、GST-Abeta的分离纯化研究 采用亲和色谱对大肠杆菌DH5α表达的目的融合蛋白GST-Abeta进行分离纯化。实验先后对GST-Abeta分离、纯化和超滤的各项实验参数进行了研究。结果表明,对工作中的凝胶系统进行轻微振荡处理能够显著提高目的融合蛋白与胶的结合与洗脱效率。薄层扫描显示纯化后的GST-Abeta纯度高达95%。 Abeta原核高效表达系统的成功构建及亲和纯化方法的建立为下一步抗Abeta单克隆抗体的制备奠定了基础。