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帕金森病( Parkinsonps Disease, PD)又称震颤性麻痹,是目前世界上第二大神经退变性疾病,但其发病机制仍不清楚。线粒体复合体I抑制、能量供应障碍、氧化应激、多巴胺代谢紊乱和蛋白降解功能障碍被认为是PD的主要发病机制。鱼藤酮(rotenone)是存在于植物毛鱼藤中的有效成分,能自然释放入自然环境造成持续性污染,也因具有强烈的麻醉和其他毒性作用,而被发展成为农用杀虫剂。近年来研究发现,该化合物对中枢多巴胺神经系统有选择性损伤作用,长期接触可引起多巴胺神经退行性变,成为当前PD病发病机制研究的热点。大量的研究显示利用多巴胺受体激动剂、单胺氧化酶抑制剂、兴奋性氨基酸抑制剂、神经肽、抗氧化剂、抑制炎症反应物质、神经营养因子、免疫抑制剂、雌激素等对帕金森病具有神经保护作用,实验研究取得了一定进展,但已开展的临床实验效果仍不理想,目前仍无完全有效的治疗药物和措施。因此,寻找探索新的有效的神经保护方法仍然是当前PD防治研究的热点和难点。西罗莫司( Sirolimus)又称雷帕霉素(Rapamycin ,Rapamune ) ,是一种35元环大环内酯类化合物,其化学结构与同类免疫抑制剂他克莫司(FK506)相似。西罗莫司与FK506结合蛋白( FKBP-12)结合形成西罗莫司-FKBP-12复合物,后者再与哺乳类雷帕霉素靶分子(mammalian target of rapamycin ,mTOR)结合,抑制mTOR活性,激活自吞噬作用,通过增强细胞内蛋白聚集物的降解而实现其对细胞的保护作用,对神经退行性疾病有潜在的治疗作用。基于以上研究进展和本科室对于鱼藤酮致帕金森病机制的研究结果,本文建立了鱼藤酮染毒PC12细胞株作为帕金森体外研究模型,探讨西罗莫司在鱼藤酮所致PC12细胞损伤的保护效应及可能的机制。目的:观察西罗莫司(rapamycin)预处理对鱼藤酮诱导PC12细胞神经损伤的保护作用,探讨西罗莫司用于防治帕金森病的可能性及其机制。方法:PC12细胞处理分为正常对照组、西罗莫司对照组、鱼藤酮染毒组、西罗莫司组和3-甲基腺嘌呤(3-MA)抑制剂干预组。4’,6-二脒-2-苯基吲哚(DAPI)免疫荧光实验检测细胞凋亡形态变化;AnnexinⅤ-FITC/PI染色检测细胞凋亡率;罗丹明123检测线粒体膜电位;吖啶橙荧光染色检测自吞噬体的形成;细胞免疫荧光和免疫组化法检测α-突触核蛋白(α-syn)表达,硫磺素S(Thioflavin S)检测细胞内蛋白聚集体的形成,蛋白印迹检测微管相关蛋白轻链3(LC3)、热休克蛋白70(HSP70)和胱天蛋白酶3(Caspase-3)的蛋白表达,生化法检测超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-Px)、一氧化氮合酶(NOS)的活力。结果:1、本课题成功地建立了鱼藤酮染毒PC12细胞模型。采用50 nM低剂量鱼藤酮处理PC12细胞24 h,出现明显的染色质浓集,并伴有细胞核固缩,核小体碎片。细胞凋亡率达6.25%,极显著高于正常对照组的3.48%(P<0.01)。抗氧化应激相关酶SOD、GSH-Px活力极显著低于正常对照组(P<0.01)。50 nM低剂量鱼藤酮处理PC12细胞72 h后胞内α-syn增加,且出现明显的聚集。144 h后与正常对照组比较出现明显的蛋白聚集。2、西罗莫司能显著改善鱼藤酮所致的PC12细胞染色质浓集、核固缩及核小体碎片的形成,降低PC12细胞的凋亡率,且具有一定的剂量依赖效应。其中200μg.L-1西罗莫司处理组比鱼藤酮染毒组凋亡率降低了40.2%(P<0.01)。3、50～200μg?L-1浓度范围内西罗莫司处理后PC12细胞内线粒体膜电位较鱼藤酮染毒组有显著升高,其中200μg.L-1西罗莫司组线粒体膜电位升高达3.17倍(P<0.01)。4、西罗莫司能显著抑制鱼藤酮所致的PC12细胞内蛋白聚集体的形成,尤其是关键蛋白α-syn聚集的形成。5、西罗莫司可显著对抗鱼藤酮引起的PC12细胞内HSP70蛋白表达降低(P<0.05),应用抑制剂3-MA可拮抗西罗莫司对PC12细胞的作用(P<0.05)6、西罗莫司处理后显著增加鱼藤酮染毒后PC12细胞内自吞噬体形成的数量(P < 0. 01),促进自吞噬体标志性蛋白LC3由Ⅰ型向Ⅱ型(P<0.01)转变;应用抑制剂3-MA可拮抗西罗莫司对PC12细胞的作用(P<0.01)。7、西罗莫司可抑制鱼藤酮引起的PC12细胞内Caspase-3蛋白的激活,其活性片段p20K降低16.2%(P<0.01)。应用抑制剂3-MA可拮抗西罗莫司对PC12细胞的作用(P<0.05)。8、在50～200μg?L-1浓度条件下西罗莫司处理后PC12细胞内SOD、GSH-Px下较鱼藤酮组有显著升高(P<0.05),NOS活力较鱼藤酮组显著降低(P<0.05)。结论:1、建立了鱼藤酮染毒PC12细胞模型。50～100 nM鱼藤酮染毒PC12细胞能够模拟多巴胺神经元染毒后发生的基本变化,包括细胞核小而亮,边缘不规则,可见染色质浓集,并伴有细胞核固缩,核小体碎片。凋亡率增加,抗氧化酶活力下降,蛋白聚集。2、西罗莫司能显著抑制鱼藤酮所致的PC12细胞染色质浓集、核固缩及核小体碎片,降低凋亡率,提高线粒体膜电位,且具有一定的剂量依赖效应。说明西罗莫司能抑制鱼藤酮所致的PC12细胞凋亡。3、西罗莫司能增加自吞噬体的形成,促进LC3蛋白由Ⅰ型向Ⅱ型蛋白转变,加强对聚集蛋白尤其是α-syn和失调线粒体的吞噬降解作用,降低线粒体相关的促凋亡因子的释放和激活,抑制Caspase-3激活片段p20、p17的产生,抑制Caspase依赖凋亡途径的激活而降低细胞凋亡。联合应用自吞噬抑制剂3-MA可以反转西罗莫司对LC3、Caspase-3蛋白的作用,进一步证实了西罗莫司通过自吞噬作用而实现其保护作用。4、西罗莫司可对抗鱼藤酮引起的HSP70蛋白表达的降低,加强对错误折叠蛋白重折叠的作用,降低细胞内泛素蛋白酶体系统负荷。5、西罗莫司能对抗鱼藤酮引起的细胞内源性抗氧化酶SOD、GSH-Px活力的降低和NOS酶活力的升高,促进胞内活性氧(ROS)的清除,减少活性氮(RNS)生成,进而降低NO/ONOO-对细胞生物膜尤其是线粒体膜的完整性和呼吸链电子传递复合体的损伤,同时可减轻NO/ONOO-对DNA的直接损伤,避免因DNA修复造成的NAD+、ATP的耗竭,从而对神经元的损伤具有一定的保护作用。综上所述,本研究通过鱼藤酮损伤PC12细胞模型,观察了西罗莫司对鱼藤酮所致细胞凋亡的抑制作用。其可能的机制是:一方面是西罗莫司上调自吞噬作用,加强对错误折叠蛋白和失调线粒体的吞噬降解作用,降低线粒体相关的促凋亡因子的释放和激活,抑制Caspase依赖凋亡途径的激活而降低细胞凋亡。另一方面可能是通过上调内源性抗氧化酶活力,降低NOS酶活力,清除胞内ROS,减少RNS生成,降低NO/ONOO-对神经元的直接损伤作用。