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近年来,作为中枢神经系统恶性肿瘤的代表,胶质瘤已经成为恶性肿瘤中关注的焦点。其典型的行为学特征是脑内侵袭力强且术后复发率高。研究胶质瘤颅内进展的相关机制能够进一步完善胶质瘤治疗方案,改善胶质瘤患者手术治疗后的转归。细胞骨架是调控细胞增殖活性及动力学状态的重要因素,其完整性对胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡等过程都至关重要。肌动蛋白丝构成了细胞骨架。正常情况下,旧肌动蛋白丝的解聚和新肌动蛋白丝的聚合保持着动态平衡,这种平衡有助于细胞的迁移和侵袭。醛缩酶A（ALDOA）作为无氧代谢酶家族中的一员,除广泛了解的代谢酶功能外,其重要的非酶功能之一是结合γ-肌动蛋白,促进其相互聚合形成纤维状的F-肌动蛋白。若阻断ALDOA与γ-肌动蛋白之间的相互作用,F-肌动蛋白的聚合将下调并被逆转形成单体G-肌动蛋白。因此细胞内G-肌动蛋白单体的囤积将用于促进新的F-肌动蛋白纤维的组装。另一方面,肌动蛋白解聚蛋白Cofilin在肌动蛋白丝的解聚中起着重要作用。我们前期对胶质瘤临床标本的高通量芯片数据中发现一个未在Ensemble与癌症基因组图谱（The cancer genome atlas,TCGA）数据库中注释的长链非编码RNA NONHSAT138818.2（我们将其命名为:lncRNA ARST）。本实验主要研究了LncRNA ARST参与ALDOA的非酶学功能调控并影响胶质瘤细胞骨架稳定性的具体作用机制。目的:1、研究lncRNAARST在脑胶质瘤中的表达情况及流行病学特征。2、体内体外实验相结合研究lncRNAARST在胶质瘤中发挥的生物学作用。3、研究胶质瘤恶性细胞行为变化过程中lncRNA ARST对醛缩酶A生物学特性的影响。4、研究LncRNA ARST通过改变醛缩酶A的生物学特性影响胶质瘤细胞系侵袭迁移能力的详细分子生物学机制。方法:第一部分:1、芯片数据筛选临床胶质瘤样本中存在表达差异的lncRNA ARST,比较其在正常组织及瘤旁组织中的表达水平差异。2、验证LncRNAARST的保守性。3、应用qRT-PCR检测lncRNA ARST在不同病理学分级的胶质瘤组织与不同胶质瘤细胞系中的表达水平。4、分析lncRNAARST的流行病学特征。利用GEPIA数据库获取其母本基因LINC00632的表达水平对患者生存时间的影响。第二部分:1、应用原位荧光杂交技术观察lncRNA ARST在胶质瘤细胞系U87MG,U251中的亚细胞定位情况。2、建立过表达lncRNAARST的胶质瘤细胞研究模型。3、研究lncRNA ARST对胶质瘤细胞系U87MG,U251的癌性行为如增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。3.1、应用CCK-8,EdU技术检测过表达lncRNA ARST对胶质瘤细胞增殖状况的影响。3.2、应用Transwell小室培养实验,划痕实验技术检测过表达lncRNA ARST对胶质瘤细胞侵袭迁移能力的影响。3.3、应用Annexin V-FITC/PI染色与流式细胞技术检测过表达lncRNA ARST对胶质瘤细胞凋亡状况的影响。4、设计含luciferase标记的lncRNA ARST质粒转染鼠胶质瘤细胞系GL261,采用C57小鼠颅内种瘤及小动物发光成像技术,体内实验检测过表达lncRNA ARST对胶质瘤进展速度的影响。第三部分:1、明确lncRNAARST的互作蛋白与功能定位。提取U87MG的总蛋白裂解液进行lncRNA ARST的RNA pull-down,质谱获取lncRNA ARST的互作蛋白列表,明确lncRNA ARST与醛缩酶A的相互作用关系。2、验证lncRNA与醛缩酶A的结合区域。以茎环结构为基础行lncRNA分段,探究醛缩酶A在lncRNA上的结合区域。3、探究胶质瘤细胞系U87MG过表达lncRNA ARST后对醛缩酶A表达水平的影响。4、分析醛缩酶A的流行病学特征。第四部分:1、探究LncRNAARST对醛缩酶A的作用机制。1.1、利用Metascape核心模块分析法猜测ARST结合醛缩酶A后对细胞生命活动的相关影响。探究过表达ARST后U87MG的代谢水平变化。1.2、利用激光共聚焦成像技术,分析不同处理组U87MG胶质瘤细胞细胞骨架结构差异。1.3、应用激光共聚焦成像技术,分析醛缩酶A免疫荧光及细胞骨架共染的不同处理组U87MG胶质瘤细胞蛋白定位分布差异。1.4、应用免疫共沉淀实验分析上调lncRNA ARST后醛缩酶A与F-actin的互作变化。2、探究骨架解聚蛋白Cofilin在lncRNA ARST过表达后的状态变化。2.1、应用免疫共沉淀实验分析lncRNA ARST过表达后cofilin与F-actin的互作变化。2.2、应用激光共聚焦成像技术,分析cofilin免疫荧光及细胞骨架共染的不同处理组U87MG胶质瘤细胞蛋白定位分布差异。2.3、借助TCGA数据库对Cofilin行流行病学分析。3、探究F-actin、醛缩酶A、cofilin与ARST的互作机制。3.1、应用CatRAPID数据库,预测醛缩酶A与lncRNAARST的结合域。3.2、设计醛缩酶A突变质粒,利用RNA pulldown技术检测醛缩酶A与ARST的结合改变。3.3、探究醛缩酶A突变质粒对F-actin-醛缩酶A、F-actin-cofilin的互作影响。4、回复实验。结果:第一部分:1、芯片数据筛选临床胶质瘤样本中存在表达差异的lncRNA ARST,检测其在正常组织及瘤旁组织中的表达水平低于肿瘤组织。2、结合NCBI、UCSC数据库相关信息验证RNA ARST不编码具有生物学意义的多肽链,进而将ARST归为lncRNA。3、应用qRT-PCR检测lncRNA ARST在不同病理学分级的胶质瘤组织与不同胶质瘤细胞系中,其表达量随胶质瘤级别升高而降低。4、利用GEPIA数据库获取ARST母本基因LINC00632的表达水平对患者生存时间的影响。结果显示胶质瘤恶性程度越高,LINC00632表达水平越低;LINC00632的表达水平与患者预后呈正相关。第二部分:1、应用原位荧光杂交技术观察lncRNA ARST主要分布于胶质瘤细胞系U87MG,U251细胞的胞质中。2、建立过表达lncRNA ARST的胶质瘤细胞研究模型。构建lncRNA ARST过表达质粒,选择胶质瘤细胞系U87MG,U251进行瞬时转染,转染后的胶质瘤细胞测定转染效率,标记为oeARST。3、研究lncRNAARST对胶质瘤细胞癌性行为的影响。3.1、应用CCK-8,EdU技术显示,过表达lncRNA ARST能有效抑制胶质瘤细胞增殖。3.2、Transwell小室培养实验,划痕实验显示,lncRNA ARST能够抑制胶质瘤细胞的侵袭迁移。3.3、Annexin V-FITC/PI染色与流式细胞术显示,lncRNA ARST的过表达促进胶质瘤细胞凋亡。3.4、C57小鼠颅内种瘤,小动物发光成像显示,过表达lncRNAARST能够有效抑制胶质瘤进展。第三部分:1、明确lncRNAARST的互作蛋白与功能定位。提取U87MG的总蛋白裂解液,进行生物素标记的lncRNA ARST的RNA pull-down实验,质谱获取lncRNA ARST的互作蛋白网并按照功能富集的相关性进行排序,Western Blot实验确定lncRNAARST与醛缩酶A结合。2、验证lncRNA与醛缩酶A的结合区域。以茎环结构为基础进行lncRNA分段,探究醛缩酶A在lncRNA上的结合区域。3、探究胶质瘤细胞系U87MG过表达lncRNA ARST后对醛缩酶A表达水平的影响。WB与qRT-PCR检测结果显示lncRNA ARST不影响醛缩酶A的转录与表达水平。4、检测醛缩酶A的流行病学特征。利用GEPIA数据库获取不同级别的胶质瘤中醛缩酶A的表达水平,及不同表达水平的醛缩酶A对患者生存时间的影响。发现不同级别的胶质瘤间醛缩酶A并无表达差异,然而针对胶质瘤患者而言醛缩酶A表达量越高,患者预后越差。第四部分:1、探究LncRNAARST对醛缩酶A的作用机制。将质谱获得的互作蛋白进行核心模块分类,确定由细胞骨架介导的细胞动力学功能与lncRNAARST及醛缩酶A相关。1.1、Metascape核心模块分析法猜测ARST与醛缩酶A的互作涉及代谢与细胞骨架领域。而过表达ARST后U87MG的乳酸水平与代谢酶无明显变化。1.2、利用激光共聚焦成像技术,观察免疫荧光及细胞骨架共染的不同处理组U87MG胶质瘤细胞,从内部骨架结构改变、蛋白定位等确定lncRNA ARST的功能为破坏细胞骨架,干扰细胞骨架形成过程。1.3、过表达ARST导致醛缩酶A与F-actin的共定位现象减弱。1.4、免疫共沉淀实验结果表明,上调lncRNA ARST能够有效抑制醛缩酶A与F-actin 结合。2、探究丝切蛋白Cofilin在lncRNAARST过表达后的状态变化。2.1、免疫共沉淀实验结果表明,上调lncRNA ARST亦可抑制cofilin与细胞骨架F-actin结合。2.2、激光共聚焦发现过表达lncRNA ARST后cofilin与F-actin结合减弱,F-actin的纤维状结构破坏,新F-actin无法形成,cofilin无法结合在残存骨架结构上而呈现出无规则游离分布的现象。2.3、TCGA数据库结果显示:cofilin在胶质瘤细胞中高表达,且表达水平与预后呈负相关。3、探究F-actin、醛缩酶A、cofilin与ARST的互作机制。3.1、根据CatRAPID数据库,预测醛缩酶A的289-340氨基酸片段是lncRNA ARST的结合域,与文献中醛缩酶A结合F-actin的结构部位重叠。3.2、RNA pulldown结果显示,醛缩酶A突变质粒78-364AA能够与ARST互作,而1-288无法实现互作。说明F-actin、ARST在醛缩酶A上的结合区域皆包括醛缩酶A289-364AA片段。3.3、胶质瘤细胞内骨架蛋白F-actin被丝切蛋白cofilin所降解形成G-actin单体,而ARST的上调抑制醛缩酶A与F-actin的结合,导致F-actin难以形成,大量单体骨架蛋白囤积,因此cofilin、醛缩酶A同F-actin的结合均减弱。4、体外回复实验与裸鼠种瘤体内实验标本切片结果相一致。结论:1、在胶质瘤样本中,LncRNA ARST的表达显著降低,且胶质瘤级别越高,表达量越低。LncRNAARST的表达与患者预后呈正相关。2、LncRNA ARST的高表达能够显著抑制胶质瘤细胞的增殖、侵袭与迁移,促进细胞凋亡。3、LncRNA ARST的高表达不影响醛缩酶A的表达,但会有效占据醛缩酶A与细胞骨架蛋白F-actin的结合区域,导致F-actin上与醛缩酶A具有重叠定位的细胞骨架解聚蛋白cofilin更高效地结合F-actin并发挥解聚骨架地功能。4、占据醛缩酶A上F-actin结合区域的lncRNA ARST会抑制醛缩酶A稳定细胞骨架的功能,导致cofilin持续破坏旧骨架且解聚后的细胞骨架不再形成新骨架,抑制胶质瘤细胞的各项生命活动,以抑制侵袭迁移能力尤为显著。