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棉纤维是最重要的纺织原料之一,它是由单个胚珠表皮细胞分化而来。纤维的发育历经纤维起始、纤维伸长、次生壁增厚及脱水成熟四个互有重叠的阶段,整个发育过程约需55天。纤维细胞发育整个过程只进行核内复制而不发生细胞分裂,细胞增长高度同步,是研究细胞发育的理想材料。同时,纤维细胞的次生细胞壁几乎全部由纤维素构成,因此,纤维发育也是研究纤维素生物合成的理想系统。棉纤维发育是一个由基因时序控制的复杂过程,阐明其机理将为利用基因工程技术改良棉纤维品质奠定良好的理论基础。
海岛棉是众多商品棉中纤维最长、品质最优的品种之一。本研究以海岛棉为材料进行了纤维发育相关基因的克隆以及纤维发育起始阶段的转录水平研究,利用构建的海岛棉差减文库,采用RACE技术首次在海岛棉中克隆了两条海岛棉纤维发育相关的全长cDNA,分别命名为GbHBI(GenBank Accession AY966446)和GbABCI(GenBank AccessionDQ359122)。
序列分析发现,GbHBI基因的全长cDNA为3061bp,具有一个443 bp的5’非翻译区(UTR,untranslated region)和110 bp的3’非翻译区及2508bp的开放阅读框,编码一个由836个氨基酸组成的蛋白,预测其分子量为91.6kDa,等电点pI为5.93。通过氨基酸序列分析发现GbHBI编码的蛋白包含一个保守的homeodomain的结构域和一个亮氨酸拉链(1eucine-Zipper)的结构域,其中homeodomain由60个氨基酸组成,紧随其后的是由28个氨基酸组成的亮氨酸拉链结构,GbHBl蛋白属于HD-zip蛋白家族,多重序列及结构域分析发现GbHBl基因属于第III亚家族。HD-Zip家族是目前发现的植物所特有的一类转录因子,其中的第III亚家族主要与植物细胞的生长发育密切相关。@ Southem杂交结果显示,GbHBl在海岛棉基因组中属于低拷贝基因。RT-PCR研究表明,GbHBl为器官差异性表达基因,在发育中的胚珠和茎中的表达量最高,而在叶和子叶中表达极低。进一步分析发现,GbHBl在0-2DPA(day post anthesis)的胚珠中表达量最高,并且一直持续这种高表达到3DPA时略有降低,直到15DPA后才开始明显降低。该结果表明,GbHBl主要在纤维伸长阶段呈现出高表达,预示着GbHBl转录因子可能参与了纤维伸长阶段的发育调控。为了进一步验GbHBl的功能,构建了含有由CaMV35S启动子引导的GbHBl基因的植物表达载体pCAMBIA1304-GbHBl,通过农杆菌GV3101介导,利用花浸染法成功转化了拟南芥微管束束间纤维发育的突变体ifll。结果发现,在ifll中过量表达GbHBl基因能使突变体的茎干柔软下垂表型恢复到野生型的直立状态。证明GbHBl基因与拟南芥IFLl基因的功能类似,和束间纤维的发育相关。
序列分析发现,GbABCl基因的全长cDNA为3424lbp,包括一个3213bp的开放阅读框,编码一个由1071个氨基酸组成的蛋白,该蛋白的预测分子量为118.4kD,等电点为6.19,和其他同类的ABC转运蛋白的大小类似。GbABCl基因的cDNA含有长度为12bp的5UTR和199bp的3端非编码区,其UTR部分比其他同类基因的短。GbABCl蛋白与拟南芥ATMRP3蛋白的同源性最高,为73%,与遏蓝菜(Thlaspicaerulescens)多药抗性相关蛋白的同源性为72%,和水稻的MRP-1ikeABC转运蛋白具有68%的同源性,和其他物种的MRP家族蛋白也有较高的相似性,推断GbABCl基因属于MRP基因家族。利用ScanProsite搜索结构域发现,GbABCl和数据库中的ABC转运蛋白具有相似的结构域,其中在1-166氨基酸和510-790氨基酸区域分别存在一个跨膜区;在200-423氨基酸和827-1061氨基酸区域分别存在一个ATP结合位点。从结构域的组织形式来看,GbABCl属于ABC转运蛋白家族中的全转运蛋白类,其组织形式为“TMDl-NBFl-TMD2-NBF2”模式。推测其功能可能与纤维发育过程中的物质转运有关。
棉纤维的起始分化发生在开花前一天(-1DPA)与开花后一天(1DPA)之间,随即进入迅速伸长阶段。为了研究棉纤维发育早期的基因调控网络,利用含12000个EST(espressed sequence tag)点阵的棉纤维cDNA芯片对-1DPA和1DPA的胚珠中基因转录水平进行了分析。结果发现,这两个阶段的基因转录水平存在很大的差异,二者差异表达的ESq?’达1376个,其中在.1DPA表达下调的EST为1072个,表达上调的EST。为304个。差异表达的EST可能与棉花纤维发育的起始相关,表明纤维的起始发育受到复杂的多基因网络的调控,而这种基因表达的差异可能也与受精和随后纤维发育的细胞分化有关。通过数据库比对分析发现,这些差异表达的EST大部分参与核酸和蛋白合成代谢,其次参与物质转运,这些都是细胞生长发育所必需的。其中,在差异表达的EST中也检测到了所发现的和棉花纤维发育密切相关的基因的同源序列,如HD-Zip家族和Myb家族以及ABC转运蛋白家族的成员。这些差异表达的EST的发现,为揭示棉纤维发育机理和纤维品质的分子改良打下了基础。