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掌叶半夏凝集素(Pinellia pedatisecta agglutinin,PPA)是一种从掌叶半夏(Pinellia pedatisecta Schott)块茎中提取并能够特异性凝集甘露糖的蛋白,属于单子叶植物凝集素家族。研究表明,掌叶半夏凝集素具有植物保护、抗肿瘤等功效。抗菌肽(Protegrin)是生物体内的一种具有抗菌活性的内生免疫原性动物蛋白。死亡素(Thanatin)是在昆虫斑腹刺益蝽(Podisus maculiventris)中发现,由21个氨基酸残基组成的抗菌肽,研究表明死亡素对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和某些真菌都有抑制作用。
肿瘤细胞的研究表明,糖链在合成水平上的差异和特殊糖基结构同肿瘤细胞的侵染具有相关性,并且掌叶半夏凝集素的融合表达具有识别甘露糖表型的实体肿瘤细胞表面的糖抗原;并且已经从分子水平证实了大部分慢性疾病都是由炎症反应失调引起的,具有抗菌活性的药物可能抑制癌症的发病或者治疗癌症。基于以上两点,本文设计了Thanatin-PPA的融合蛋白,分别保留了掌叶半夏凝集素抗肿瘤活性和死亡素抗菌活性,并且融合蛋白表达时,为了避免融合蛋白表达时影响蛋白高级结构的正确折叠以及蛋白的活性,在两个蛋白之间引入10个氨基酸残基的柔性肽。
本文首先通过从掌叶半夏块茎中提取总RNA,设计引物克隆编码掌叶半夏凝集素的基因ppa;通过重叠PCR分别将编码柔性肽基因和死亡素基因融合到ppa5端,得到编码融合蛋白的基因ppa-linker-thanatin。融合基因经测序分析显示克隆成功。
本文将融合基因连接到pET32a表达载体上,转化到DH5α感受态细胞中,经酶切鉴定和测序分析,然后转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,IPTG诱导融合蛋白的表达。融合蛋白分子量为32kDa且主要表达在包涵体中,包涵体经洗涤、稀释复性和纯化,用于后续实验。
本文构建酵母表达载体pPIC3.5K-pt,重组质粒经酶切鉴定和测序分析显示构建成功。pPIC3.5K-pt经SalI单酶切线性化后电转插入到毕赤酵母菌株GS115染色体中。pPIC3.5K/pt在表达培养基中经甲醇诱导表达,蛋白经Ni柱纯化后显示为31kDa左右的单一条带。
本文进行了原核表达蛋白的凝血活性、抗菌活性和体外抗肿瘤活性的分析。融合蛋白在表达过程中抑制宿主细菌的生长;以半夏新鲜蛋白为对照的凝血活性显示融合蛋白具有凝集兔血红细胞的作用,但凝集活性有一定的降低;体外MTT显示融合蛋白具有显著的抑制Hela、Beas-2B、Huh7和7721四种肿瘤细胞生长的作用,并且和蛋白浓度有一定的相关性。融合蛋白具有显著的抗肿瘤效果,具有广泛的市场前景。