鸡血藤为常用药材,2010年版《中华人民共和国药典》一部收录其为豆科植物密花豆Spatholobus suberectus Dunn的干燥藤茎。具补血、活血、通络的功效,临床上主要用于月经不调、血虚萎黄、麻木瘫痪、风湿痹痛等症。广泛用于妇科、风湿痹痛等类型的中成药生产和配方用药中,如新血宝胶囊(颗粒)、补血调经片等广东省著名中成药企业生产产品的处方药材,药用需求量大。正品鸡血藤为多年生藤茎类野生药材,生长慢,少有人工种植,随着药用需求量的不断攀升,野生资源蕴藏量逐渐减少,渐呈紧缺的状态。目前,国内药材产量已经濒临枯竭,商品药材多从越南,老挝,柬埔寨、缅甸等东南亚各国进口,但产地国开始采取措施保护本国的生态环境和资源,限制了出口量,将影响我国对鸡血藤的用药需求。另一方面,鸡血藤商品药材基原植物除了《中国药典》收载的密花豆外,还有豆科、五味子科、木通科等共6个属15种和变种的植物,如常春油麻藤、香花崖豆藤及红血藤等,它们的主治功效不尽相同,临床上不可混用。因此,对不同居群野生鸡血藤种质资源进行鉴定与评价研究,对开展正品鸡血藤药材野生转家栽规范化种植研究具有重要指导意义；同时开展正品鸡血藤与其常见混淆品的鉴别研究,找出其鉴别特征与依据,对确保鸡血藤药材的准确入药亦具有重要意义。国内外对鸡血藤的相关研究也较多,但目前对正品鸡血藤的研究主要集中在化学成分、药理作用等方面,而种质收集、鉴定及药材品质评价等方面的研究很少。鉴于上述诸多因素,为了确保鸡血藤药材药用基源的准确和药材质量的稳定,本论文在对鸡血藤文献研究的基础上,对鸡血藤种质的自然分布区进行资源种类及分布调查、收集与鉴定并对其品质进行评价。具体内容如下：第一部分文献研究查阅了大量的鸡血藤药材研究资料以及与本研究相关的文献资料,系统的总结了前人的研究成果与存在的问题,针对鸡血藤药材种质资源与鉴定、药材质量控制与评价等方面存在的薄弱环节提出了本论文的研究内容与目标。第二部分实验研究一、鸡血藤类药材种质资源的收集与鉴定1.鸡血藤种质的调查与收集1.1资源分布状况正品鸡血藤药材主要野生分布于广东省东北部、中部、南部,广西壮族自治区和云南省。但由于产地国开始采取措施保护本国的生态环境和资源,以及药用需求量的日益骤增。近年来,国内开始有野生转家栽的种植研究。1.2鸡血藤种质的收集本论文在对鸡血藤主要分布区资源调查的基础上,共收集了广东省广州、从化、深圳、梅州、罗定,广西岑溪、贺州八步镇等地10份正品鸡血藤野生及栽培种质,并从全国不同省市收集了14份商品药材。1.3鸡血藤混淆品的收集实地采集6种鸡血藤混淆品。采用植物分类学方法对所收集的样品进行鉴定,分别为大血藤(Sargentodoxa cuneata (Oliv.) Rehd. Et Wils.)、香花崖豆藤(Millettia dielsiana Harms)、白花油麻藤(Mucuna birdwoodiana Tutch)、厚果鸡血藤(Millettia pachycarpa Benth.)、常春油麻藤(Mucuna sempervirens Hemsl.)及鱼藤(Derris trifoliata Lour)。另收集了1种商品药材异形南五味子(Kadsura heteroclita (Roxb.) Craib)的藤茎。2.鸡血藤类药材的种质鉴定2.1鸡血藤原植物形态特征的观察与描述利用植物分类学方法,对所收集的正品鸡血藤的原植物形态及花的性状特征进行观察与描述。花多而密；序轴及总花梗被黄色短柔毛；小花蕾呈椭圆形,长1.60～1.67cm。小花花柄短,长0.24～0.50cm,绿色,表面被细毛。花萼肉质筒状,先端具4齿,其一齿较大,淡黄色,被白毛,长0.71-0.94 cm。花冠蝶形,白色,肉质,长1.15～1.38 cm,旗瓣长0.65～0.85 cm,宽0.61-0.85cm；翼瓣长0.59～0.81 cm,宽0.24～0.42 cm；龙骨瓣长0.48～0.62 cm,宽0.21～0.28 cm；雄蕊10枚,二体雄蕊,长0.79～0.90 cm,花丝白色,花药黄色；雌蕊1枚,长0.75～1.03 cm,柱头色浅,子房被白色硬毛。2.2鸡血藤原植物花粉粒的扫描电镜观察采用扫描电镜观察正品鸡血藤花粉粒的形态特征。密花豆花粉粒多近球形、长球形或橄榄球形,赤道面观为类椭圆形,极面观为类圆锥形,具三孔沟,沟缘整齐,沟两端较中部狭窄,末端尖或钝,长达两极；表面具不规则点坑状雕纹和少量洞穴状雕纹,点坑状雕纹较浅,极面纹饰微弱。极轴与赤道轴的比值(P／E)为1.74～2.0。2.3鸡血藤与其常见混淆品的薄层色谱鉴别采用薄层层析法,对鸡血藤及其常见混淆品进行薄层色谱鉴别。薄层层析分析结果显示,鸡血藤与其常见混淆品在化学成分上具有明显差异。以原儿茶酸、大豆苷元、染料木素、芒柄花素作对照品,分别以三氯甲烷-甲醇-甲酸(7：1：0.2)、三氯甲烷-丙酮-甲酸(8：1：0.5)作展开剂展开,置紫外灯(254nm)下观察荧光萃灭点,可将鸡血藤与其常见混淆品区别开。该方法能简便、快捷地鉴别鸡血藤与其常见混淆品。2.4鸡血藤与其常见混淆品的RAPD分析采用随机扩增多态性DNA标记(random amplified polymorphic DNA, RAPD)技术对不同居群正品鸡血藤进行DNA多态性分析。从110条引物中筛选出9条引物扩增出条带,扩增的多态性条带清晰、重复性好。8个不同居群鸡血藤共扩增出100个位点,其中多态性位点40个,占40%。采用Ntsys2.10软件,UPGMA (unweighted pair-group method with arithmetic means,非加权组平均法)聚类,并构建聚合树状图。聚类分析结果显示,8个不同居群正品鸡血藤归为两大类。鸡血藤与其常见混淆品RAPD-PCR分析结果显示,其DNA指纹图谱具有明显差异,为鸡血藤与其常见混淆品的分子鉴定提供科学依据。二、鸡血藤化学成分研究采用柱层析、薄层层析、重结晶法对鸡血藤药材乙醇提取物的石油醚部位、三氯甲烷部位及醋酸乙酯部位的化学成分进行分离、纯化,并利用核磁共振、质谱等方法对分离得到的单体成分进行结构鉴定。共鉴定出5个成分,分别为正二十七烷酸、3,7-二羟基-6-甲氧基二氢黄酮醇、芒柄花素、p-谷甾醇、4’,8-二甲氧基-7-O-β-D-葡萄糖基异黄酮。其中化合物4’,8-二甲氧基-7-O-β-D-葡萄糖基异黄酮为首次在本科属植物中发现。三、鸡血藤药材的质量分析与评价1.鸡血藤药材性状特征的观察与描述对不同居群鸡血藤及商品鸡血藤药材的性状特征进行分析比较,其藤茎粗度和断面含树脂的偏心性环纹数及树脂色泽具明显差异。表明,不同居群鸡血藤及商品药材质量参次不齐。2.不同居群鸡血藤药材薄层色谱鉴别对不同居群鸡血藤药材醇提物的醋酸乙酯部位进行薄层层析,置紫外灯(365 nm)下可以辨认13个荧光斑点,Rf值依次为0.96、0.91、0.80、0.76、0.69、0.65、0.56、0.49、0.45、0.38、0.29、0.24、0.09。其中Rf值在0.2-0.8之间的占76.9%。采用Ntsys2.10软件,UPGMA法对不同居群鸡血藤药材薄层色谱图进行聚类分析,构建其内在化学成分关系树状图,结果显示,共聚为两大类,四小类。其中,来源于三元里、八步(野)和英德归为第一类；梧桐山、岑溪和罗定归为第二类；从化和布吉归为第三类；平远GAP和平远(商品)、八步(栽)归为第四类。3.鸡血藤活性成分的含量测定采用RP-HPLC法同时测定不同居群鸡血藤野生种质及商品鸡血藤药材中中原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素的含量。结果显示,鸡血藤商品药材中原儿茶酸、儿茶素及表儿茶素的含量差异较明显,商品药材质量参差不齐。第三部分结论1.鸡血藤原植物花粉粒扫描电镜观察结果显示,花粉粒多呈近球形、长球形或橄榄球形。赤道面观为长椭圆形,极面观为三裂圆形,具三孔沟,沟缘整齐,沟两端较中部狭窄,末端尖或钝,长达两极；表面具不规则点坑状凹穴较浅,极面纹饰微弱。极轴与赤道轴的比值(P／E)约为1.74-2.0。2本文首次建立了鸡血藤及其常见混淆品(大血藤、白花油麻藤、常春油麻藤、香花崖豆藤及异型南五味子)的薄层色谱鉴别方法。研究结果显示,以原儿茶酸、大豆苷元、染料木素、芒柄花素作对照品,分别以三氯甲烷-甲醇-甲酸(7：1：0.2)及三氯甲烷-丙酮-甲酸(8：1：0.5)展开系统照本文薄层色谱条件展开、检识,可将鸡血藤与其常见混淆品区别开。本法操作简便、快捷。3本文运用RAPD分析技术,对不同居群正品鸡血藤野生种群的DNA遗传多态性进行了分析。建立了鸡血藤的RAPD反应和扩增体系。从110条随机引物,筛选出9条有效引物,共扩增出100个位点,其中多态性位点40个,占40%。运用Ntsys2.10软件,UPGMA聚类分析结果显示,八个不同居群鸡血藤野生种质可归为两大类,深圳布吉山顶与广州三元里的遗传相似性系数为0.46,遗传距离远；广东罗定与广西岑溪的遗传相似性系数为0.84,距离最近。4本文首次建立了鸡血藤与其常见混淆品(大血藤、香花崖豆藤、鱼藤、常春油麻藤、厚果鸡血藤)的DNA指纹图谱。研究结果显示,正品鸡血藤与其常见混淆品的DNA图谱具明显差异,能很好地鉴别鸡血藤与其常见混淆品,为鸡血藤类药材的分子鉴定提供参考。5本文从鸡血藤乙醇提取物的石油醚、三氯甲烷及醋酸乙酯部位分离、纯化出9个成分,鉴定出其中5个成分。其中,3个黄酮类成分,分别为芒柄花素、3,7-二羟基-6-甲氧基二氢黄酮醇,4’,8-二甲氧基-7-O-β-D-葡萄糖基异黄酮。1个脂肪酸类成分：正二十七烷酸；1个甾醇类成分：β-谷甾醇。其中化合物4’,8-二甲氧基-7-O-β-D-葡萄糖基异黄酮为首次在本科属植物中发现。6本文对不同居群鸡血藤药材进行了薄层色谱研究,所得的薄层色谱图于365 nm下可以辨认13个荧光斑点。用Ntsys2.10软件,UPGMA法聚类分析不同居群鸡血藤种质间化学成分多样性。结果表明,10个不同居群和1个商品鸡血藤药材大致可以分为四类：第一类：三元里、八步与英德；第三类：梧桐山、岑溪与罗定；第三类：从化与布吉；第四类：平远GAP与平远商品、八步(栽)。7本文采用HPLC法对鸡血藤类药材中原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素进行含量测定,建立了测定此3种活性成分含量的方法。样品测定结果显示,鸡血藤商品药材中原儿茶酸、儿茶素及表儿茶素的含量差异较明显,表明商品药材质量参次不齐；不同居群鸡血藤藤茎中上述3种成分的含量亦具较明显的差异。用SPSS16.0对其3种成分的含量进行聚类分析,20个样品总共可以分为三大类,结合三种成分含量可以看出,Ⅲ含量较高,Ⅱ其次,Ⅰ较低。