论文部分内容阅读
[研究背景与目的]糖原合成激酶-3(GSK-3)是一种多功能丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,可参与肿瘤形成中Wnt/β-catenin、NF-κB等多个信号传导通路,GSK-3的表达、细胞内定位及活性与肿瘤细胞的生长、增殖、凋亡及分化过程密切相关,是目前肿瘤研究中重要靶标之一[1-2]。pym-5是一种新型1H-吡唑-3-甲酰胺衍生物,体外激酶谱筛选表现出对GSK-3β的强烈选择性[3]。本研究选择化合物pym-5作为GSK-3[β的抑制剂对多种肿瘤细胞类型展开研究,确证其作用方式并阐明其确切的作用机制。[研究内容与结果]1.本实验研究首先运用小鼠黑色素瘤细胞B16、B16BL6对pym-5对肿瘤细胞分化水平的影响展开研究,通过增殖实验确认了 pym-5及前体AT7519对小鼠黑色素瘤细胞体外水平的抑制作用,通过流式细胞术检测pym-5对小鼠黑色素瘤细胞细胞周期的影响。2.在确定给药剂量及时间的基础上,通过WesternBlot手段观察pym-5对小鼠黑色素瘤细胞中GSK-3β的抑制作用,通过免疫荧光观察到,pym-5可以影响GSK-3β下游β-catenin的入核。3.通过对黑色素瘤中GSK-3β及β-catenin进行生物信息学分析,确认了黑色素瘤中的MITF与GSK-3β及β-catenin相关性最为密切,且GSK-3β对黑色素瘤的影响集中体现在wnt信号通路及细胞分化周期方面,提示我们pym-5可能通过抑制GSK-3β影响下游MITF的表达,最终对小鼠黑色素瘤细胞的分化产生影响。4.通过rt-qPCR、黑色素生成测定、酪氨酸酶活性测定等试验,确证了上述猜想。最终,通过Crispr/cas 9方法敲除细胞中GSK-3β,确证了 GSK-3β即为pym-5影响小鼠黑色素瘤细胞分化的靶点。5.选择人非小细胞肺癌细胞A549、人乳腺癌细胞MDA-MB-231对pym-5引起的细胞自噬方面进行进一步探索。在细胞形态学及蛋白水平上正反向验证了 pym-5还可通过影响GSK-3β下游底物β-catenin的磷酸化,促进GSK-3β介导的Mcl-1降解,促进人非小细胞肺癌细胞A549、人乳腺癌细胞MDA-MB-231发生细胞自噬。[结论与意义]基于以上结果,我们发现:一方面,pym-5可通过抑制GSK-3β影响β-catenin的入核,继而影响下游MITF的转录和表达,最终对小鼠黑色素瘤细胞的分化产生影响;另一方面,pym-5可通过影响GSK-3β下游底物β-catenin的磷酸化,促进GSK-3β介导的Mcl-1的降解促进多种肿瘤细胞发生细胞自噬。该课题确证了 pyrm-5对多种肿瘤细胞抑制作用的主要作用靶标为GSK-3β,并明确了 pym-5促进肿瘤细胞分化及自噬的分子机制,为pym-5进入新药研究提供了一个有力的证据。