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CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是广泛存在于细菌和古细菌中一种能抵抗外来质粒或者细菌入侵的天然防御系统,是继ZFNs和TALENs之后第三代基因编辑技术。该系统由双链指导RNA(single guide RNA, sgRNA)指导Cas蛋白对特定位点的靶标进行识别和切割,Cas蛋白有一个HNH结构和RuvC-like结构分别切割DNA双链中一条链,从而实现靶位点双链断裂。随着人们对CRISPR/Cas9系统研究的不断深入,其设计简单、高效率、靶向性强等优点被视为一种具有广阔应用前景的靶基因修饰技术。CRISPR/Cas9系统虽然被广泛研究,但应用于水稻的研究都集中于瞬时表达或T0代靶位点突变效应的研究,本文探索了此系统应用于植物遗传转化的载体构建的最优体系,并对水稻中实现靶基因突变的效率及其在后代中的遗传进行了研究。为CRISPR/Cas9技术的广泛应用提供借鉴,基因组编辑技术是未来农作物品质改良的主要途径,从而有利于培育农作物更优质及多抗性的优良品种提供新思路、新方法。本研究首先设计CRISPR/Cas9系统中的Cas9基因和sgRNA,利用双元载体以农杆菌介导于植物中表达,在水稻中研究CRISPR/Cas9系统的功能和其遗传性。通过设计的5个靶位点分别构建表达载体摸索最优体系,并将其中3个构建好的表达载体导入到水稻台北309(TP309)中。主要研究结果如下：1.分别将Cas9基因和sgRNA的表达框构建在双元载体pCAMBIA1301上,形成一个能用于植物遗传转化的双元载体POsU3gRNA-2NLSCas9-1301.2.构建表达gRNA-Cas9组件的5个植物表达载体Xa5-1-pOsU3gRNA-2NLSCas9-1301、Xa5-2-pOsU3gRNA-2NLSCas9-1301、Badh2-pOsU3gRNA-2NLSCas9-1301、 GAI-pOsU3gRNA-2NLSCas9-1301、LTR-pOsU3gRNA-2NLSCas9-1301,探索靶位点与通用载体pOsU3gRNA-2NLSCas9-1301克隆的最优体系。发现靶序列在退火温度为55℃-60。C时,与通用载体pOsU3gRNA-2NLSCas9-1301克隆连接摩尔比为5：1时克隆效率最高。3.利用农杆菌介导分别将Xa5-1-pOsU3gRNA-2NLSCas9-1301、 Xa5-2-pOsU3gRNA-2NLSCas9-1301、Badh2-pOsU3gRNA-2NLSCas9-1301这3个植物表达载体导入到TP309愈伤组织,经过多次筛选分化及生根,将转基因苗转移到田间种植,并对其T0代植株DNA进行分子检测。最终得到Xa5-1-pOsU3gRNA-2NLSCas9-1301的转基因阳性植株17株,Xa5-2-pOsU3gRNA-2NLSCas9-1301的转基因阳性植株19株,Badh2-pOsU3gRNA-2NLSCas9-1301的转基因阳性植株38株。4.在转基因愈伤分化阶段分别进行靶位点突变的检测。利用PCR及酶切方法检测靶标突变效率,发现靶位点Xa5-1和Xa5-2于阳性转基因愈伤分化阶段有突变发生,而靶位点Badh2未发生突变。5.对T0代转基因植株进行靶位点突变的检测。利用PCR及酶切方法,并测序,发现靶位点Xa5-1的17株中有7株发生了定点突变,突变率为41%；靶位点Xa5-2的19株中有12株发生了定点突变,突变率为63%；靶位点Badh2未有检测到定点突变。6.对T1代转基因植株进行靶位点突变的检测。利用PCR及酶切方法,并测序,结果表明靶位点Xa5-1和Badh2未有检测到定点突变,靶位点Xa5-2有3株发生突变,其突变类型与T1代相同,遗传率为25%。7.对Tl代Xa5-1-pOsU3gRNA-2NLSCas9-1301和Xa5-2-pOsU3gRNA-2NLS Cas9-1301转基因植株接种白叶枯病菌P2,结果表明均为感病。