Austin(1951)和Chang(1951)分别报道,家兔精子进入雌性生殖道,与卵子结合形成受精卵之前,获得使精子受孕的能力,称之为‘获能’。获能后的精子发生超激活运动、质膜胆固醇含量减少、酪氨酸磷酸化增强和引发顶体反应等,并且大量研究表明酪氨酸磷酸化对于精子的获能尤为重要,但是其完整的分子机制和信号通路始终不是很清楚。本课题旨在发现人类精子获能过程中新的发生磷酸化修饰改变的蛋白,以及关键酪氨酸磷酸化激酶,并进行其功能性研究,为临床相关疾病提供诊断和治疗的候选分子靶标。为了全面的发现精子获能过程中哪些蛋白质发生了磷酸化修饰的改变,我们运用IMAC-TiO2磷酸肽双富集和LTQ Orbitrap Velos质谱仪相结合的非标记定量策略,构建了正常人类精子获能前后(体外获能培养Oh、2h)磷酸化修饰差异谱,共鉴定3350个磷酸化肽段,1017个磷酸化蛋白。t检验统计,获能后磷酸化水平升高2倍以上的磷酸化蛋白有99个,获能后磷酸化水平下降2倍以上的磷酸化蛋白有11个,获能后磷酸化水平升高2倍以上的酪氨酸磷酸化蛋白有18个,获能后磷酸化水平下降2倍以上的酪氨酸磷酸化蛋白仅有1个。此外,对磷酸化水平升高2倍以上的99个磷酸化修饰蛋白做了深入的生物信息学分析,使用NetworKIN激酶预测软件分析出IGF1R(Insulin-like growth factor 1 receptor)和INSR(Insulin receptor)两个酪氨酸磷酸化激酶的富集最有意义,提示IGF1R/INSR可能是精子获能过程中重要的酪氨酸磷酸化激酶。根据激酶预测的结果,Western Blotting实验证实GSK1904529A(同时抑制IGF1R和INSR激酶活性的抑制剂)和NVP-AEW541(特异性抑制IGF1R激酶活性的抑制剂)抑制了精子获能过程中的酪氨酸磷酸化水平。运用计算机辅助精子分析(CASA)的方法结合精子体外获能培养的技术平台,我们研究了IGF1R和INSR激酶在精子获能过程中的功能。CASA结果显示,IGF1因子(100ng/ml)在获能6h时能够诱导精子发生超激活运动,该过程可被GSK1904529A和NVP-AEW541所抑制。而Insulin因子(100ug/ml)对精子的超激活运动无影响。这一结果提示IGF1R可能是精子获能过程中关键性的酪氨酸磷酸化激酶。另外,测钙的结果显示IGF1因子(100ng/ml)能诱导获能精子细胞内钙离子浓度的升高,与GSK1904529A相比,NVP-AEW541强烈抑制了获能精子细胞内的钙离子水平。根据这一结果我们推测精子获能过程中,IGF1R可以当做离子通道的调制器,一旦配体发生结合,IGF1R就会导致电压依赖性钙离子通道的激活,引起大量的钙离子瞬间增加。综上所述,人类精子获能前后磷酸化修饰差异谱系中预测的IGF1R/INSR激酶可能是精子获能过程中重要的酪氨酸磷酸化激酶。通过功能学实验,我们推测IGF1R介导的酪氨酸磷酸化修饰调控通路在精子获能过程中可能发挥了更为关键的作用,这一过程不仅影响了精子的超激活运动,同时也参与了获能过程的钙离子水平的调控。