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研究背景及目的肿瘤侵袭转移被认为是恶性肿瘤导致患者死亡的最重要因素,因此深入阐明肿瘤侵袭转移的分子机制是提高患者生存的关键。研究发现,肿瘤细胞由原来的上皮细胞转化为具有移行能力的间质细胞并获得侵袭和迁移能力,即上皮间充质转化(EMT),是恶性肿瘤获得迁移和侵袭能力的关键。肿瘤细胞发生EMT及侵袭转移是由细胞内一系列基因表达改变决定的,包括蛋白分子,miRNAs等。研究者课题组前期工作发现miR-214在肺腺癌细胞EMT过程中表达显著上调,进而通过抑制抑癌基因sufu的表达,最终促进肺腺癌细胞EMT化。但是又是什么分子调控着肺腺癌EMT过程中的miR-214的上调表达呢?TWIST1是近年来备受关注的癌基因之一,被认为是调控EMT过程的关键转录因子。TWIST1除了可以调节编码基因外,还可以调节miRNA的表达实现对EMT过程的调控。一部分miRNA直接或间接地作用于TWIST1的上游,调节TWIST1的表达。TWIST1又可以直接或间接调控一部分miRNA的转录,通过不同的通路机制来调控下游的发生发展,从而影响肿瘤细胞的EMT过程以及侵袭转移。这意味着TWIST1和miRNA之间存在着错综复杂的网络关联,它们之前的相互调控在肿瘤的发生、发展和侵袭转移过程中发挥着不一样的作用。最为关键的是,有报道称TWIST1调节7.9kb的非编码RNA的转录,而这些非编码RNA的作用正是编码miR-199a/214miRNA。基于上述证据,我们推测正是TWIST1调节了肺腺癌细胞EMT过程中的miR-214的上调表达。本课题将对肺腺癌细胞EMT过程及侵袭转移的发生及机制进行探讨。研究方法1.研究TWIST1基因在肺腺癌病人中的表达与预后关系经real-timePCR法及western blot法检测TWIST1和miR-214在肺腺癌组织中的表达;新鲜组织样本real-timePC检测分析TWIST1和miR-214之间的相关性;通过基因库分析TWIST1基因水平高低与临床病理分期和预后相关性,以及生存曲线和生存预后分析。2.检测TWIST1基因在肺腺癌EMT状态及分化过程中CSCs上的表达经real-time PCR法及western blot法检测缺氧诱导、TGF-β诱导的二种EMT体外诱导模型中的TWIST1表达情况,同时检测分化过程中CSCs上的表达。3.TWIST1基因在肺腺癌EMT及侵袭转移中的作用慢病毒干扰TWIST1表达后,经real-time PCR法、western blot法及免疫荧光法检测TWIST1表达变化所引起的EMT相关蛋白的改变情况。体外经transwell迁移及基质胶侵袭实验,分析TWIST1表达变化对肺腺癌侵袭转移能力的影响。4.TWIST1基因介导miR-214表达的鉴定和功能研究经real-time PCR法、western blot法及免疫荧光法观察干扰TWIST1表达后,对miR-214及sufu表达的影响。研究结果1.TWIST1基因在肺腺癌临床样本中呈高表达TWIST1和miR-214在肺腺癌肿瘤组织中均是高表达,并且TWIST1和miR-214的表达呈显著正相关关系。我们通过基因库分析发现TWIST1基因水平高低与复发、分期密切相关。TWIST1基因表达水平低的患者更能获得相对较长的生存期,Cox比例风险回归模型分析显示TWIST1基因是重要危险因素。2.TWIST1在肺腺癌EMT过程中呈高表达在基因水平和蛋白水平上,TWIST1在两种肺腺癌EMT模型中均呈高表达;TWIST1在肿瘤干细胞上表达明显高于普通肿瘤细胞。3.TWIST1促进肺腺癌细胞EMT化及侵袭转移:在检测基因水平和蛋白水平上,干扰TWIST1表达后的肺腺癌细胞其EMT化显著被削弱,TWIST1可以增强肺腺癌细胞的侵袭转移能力。4.TWIST1在肺腺癌细胞中介导miR-214的上调表达干扰TWIST1表达后可见miR-214表达明显下降,而miR-214的靶基因SUFU表达则显著增强。结论1.TWIST1基因在肺腺癌组织中高表达,其表达水平与肺腺癌的复发、分期密切相关,是肺腺癌预后不良的重要因素2.TWIST1在肺腺癌细胞发生EMT过程中表达明显上调。3.TWIST1促进肺腺癌细胞的EMT化,并能增强侵袭转移能力。4.TWIST1和miR-214在肺腺癌组织中表达呈显著正相关,TWIST1通过介导miR-214的表达从而促进肺腺癌细胞EMT过程及侵袭转移。