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背景及目的:原发性肝癌(primary liver cancer,PLC)是我国常见的恶性肿瘤之一,其死亡率在消化系统恶性肿瘤中高居第3位,具有发病隐匿、进展迅速、治疗困难、死亡率高等特点,成为世界范围内恶性肿瘤高发病率和死亡率的主要因素,当前治疗原发性肝癌的方式主要是以手术切除为主,结合术前或术后放化疗,微创治疗及生物治疗的模式。随着医学技术的不断发展及对肿瘤研究的不断深入,恶性肿瘤的免疫靶向治疗方式成为目前研究的热点,其中T细胞免疫和B7家族中负性共刺激分子B7-H4在肿瘤细胞发生发展过程中的免疫应答越来越受到重视。在肿瘤免疫应答过程中T细胞介导的细胞免疫起关键作用,T淋巴细胞活化及抗原特异性T细胞免疫应答的产生及维持至少需要2个信号:第一信号由位于抗原提呈细胞(APC)上的抗原肽-组织相容性抗原(MHC)与T细胞表面的受体(TCR)相互识别作用产生;第二信号由位于APC上的刺激分子与T细胞上相对应的受体结合产生,又称协同共刺激信号。共刺激信号传导途径一方面增强T细胞免疫应答过程中的正性第二信号,另一方面下调T细胞免疫应答过程中的负性第二信号,在缺少TCR第二信号的情况下,会导致T淋巴细胞克隆无能或抑制T淋巴细胞的活化与功能,最终导致免疫抑制及免疫逃逸。负性共刺激分子B7-H4属于B7免疫球蛋白超家族,目前研究表明在肿瘤中B7-H4对T细胞免疫应答具有显著的负性调节作用,目前是肿瘤免疫治疗的研究热点。对于该课题,我们课题组前期已经作了一些相关研究并取得一定成果:(1)采用免疫荧光技术对80例人原发性肝癌和癌旁组织,20例正常肝组织中B7-H4的表达进行相关检测。统计学分析结果表明:人原发性肝癌组织中B7-H4的表达显著高于肝癌旁组织和正常肝组织。(2)采用荧光免疫组化染色检测80例人肝癌组织中B7-H4的表达与CD4+T、CD8+T细胞浸润程度及功能性细胞因子TGF-β1、IFN-γ分泌相关性。统计学分析结果表明:人原发性肝癌组织中B7-H4的表达水平与肝癌内CD4+T,CD8+T淋巴细胞浸润程度,功能性细胞因子TGF-β1和IFN-γ分泌均呈负相关。(3)采用Western Blot技术检测人原发性肝癌及癌旁组织中纯化分离出CD8+T细胞中B7-H4,IFN-γ及自噬上游信号通路PI3K-AKT-m TOR相关蛋白的表达情况。结果表明:与癌旁组织相比,肝癌组织纯化分离出CD8+T细胞中B7-H4表达明显上调,细胞因子IFN-γ表达明显下降;CD8+T细胞中P-AKT/AKT,P-m TOR/m TOR比值上升。提示原发性肝癌组织CD8+T中B7-H4表达上调可能通过PI3K/AKT/m TOR信号通路促进CD8+T细胞发生异常自噬。结合前期实验结果,本次实验主要检测从人原发性肝癌及癌旁组织中纯化分离出CD8+T细胞中的自噬下游信号通路中ATG7、ATG5-ATG12、LC3I、LC3II相关蛋白及ATG7 m RNA、LC3II m RNA的表达情况,探讨人原发性肝癌组织中B7-H4高表达对T细胞免疫抑制的影响。方法:本次实验首先采用免疫磁珠分选技术从同一来源的新鲜人原发性肝癌组织及癌旁组织中纯化分离出CD8+T细胞,一方面利用Western Blot技术分别检测两组CD8+T细胞中自噬下游信号通路中ATG7、ATG5-ATG12、LC3I、LC3II相关蛋白的表达情况;另一方面利用荧光定量PCR技术分别检测两组CD8+T细胞中ATG7及自噬标志性蛋白LC3II的m RNA表达情况。应用SPSS13.0软件对实验数据进行统计学分析,采用的统计方法为:两样本的t检验,在P<0.05时差异具有统计学意义。从而探讨人原发性肝癌组织中B7-H4高表达对T细胞免疫抑制的影响。结果:(1)自噬相关蛋白LC3I在原发性肝癌CD8+T细胞中的表达明显低于癌旁组织,差别具有统计学意义(t=6.72,P=0.001)。(2)自噬标志性蛋白LC3II在原发性肝癌CD8+T细胞中的表达明显高于癌旁组织,差别具有统计学意义(t=6.68,P=0.001)。(3)自噬相关蛋白ATG7在原发性肝癌CD8+T细胞中的表达明显高于癌旁组织,差别具有统计学意义(t=4.49,P=0.004)。(4)自噬相关蛋白ATG5-ATG12在原发性肝癌CD8+T细胞中的表达明显高于癌旁组织,差别具有统计学意义(t=4.72,P=0.003)。(5)ATG7 m RNA在原发性肝癌CD8+T细胞中的表达明显高于癌旁组织,差别具有统计学意义(t,=4.14,P=0.025)。(6)LC3II m RNA在原发性肝癌CD8+T细胞中的表达明显高于癌旁组织,差别具有统计学意义(t=4.29,P=0.005)。结论:自噬下游信号通路中ATG7、ATG5-ATG12、LC3II相关蛋白的表达在原发性肝癌组织CD8+T细胞中明显高于癌旁组织,自噬相关蛋白LC3I的表达在原发性肝癌组织CD8+T细胞中明显低于癌旁组织;同时,ATG7及LC3II的m RNA的表达在原发性肝癌组织CD8+T细胞中明显高于癌旁组织,与其蛋白的表达趋势一致,结合实验结果我们可以推论人原发性肝癌组织中B7-H4的高表达,导致CD8+T细胞中PI3K-AKT-m TOR信号通路的激活,进而激活下游自噬相关因子,使CD8+T细胞发生异常自噬,抑制T细胞的免疫功能,降低了T细胞的抗肿瘤效应,使肿瘤产生免疫抑制和免疫逃逸的现象。