研究目的 器官移植已被公认为是治疗终末期终末期器官功能衰竭的最佳手段。尽管免疫抑制剂的发展迅速，其抗排斥效果日趋完善，但急性排斥反应仍然是影响器官功能恢复的重要因素，它对移植器官的远期存活有着显著的影响，积极预防是一个重要的环节，而对急性排斥反应的早期诊断，则是利于临床进行及时和有效的治疗的重要条件。移植物活组织病理检查是诊断急性排斥反应的金标准，但受到医院条件、病人的观念以及穿刺活检可能出现的并发症的影响，而依靠临床表现及试验性治疗已不能满足临床诊断的需要；因此，需要寻找一种方便、有效、可靠而无创的诊断方法。根据急性排斥反应的发生机理，外周血淋巴因子的检测是一种途径，其中穿孔素(perforin,P)和颗粒蛋白酶B(granzyme B,GB)是近来研究的热点。本研究在探索建立稳定的、重复性强的大鼠急性排斥反应动物模型基础上，动态监测大鼠异体异位心脏移植外周血中穿孔素和颗粒酶B的表达水平，并与相应期的病理改变对比，判断其与急性排斥反应的相关性；进一步通过对临床急性排斥反应病例的研究，根据其在肾移植术后急性排斥反应过程中的变化规律，明确急性排斥反应过程中外周血穿孔素和颗粒蛋白酶B mRNA的表达在急性排斥反应过程中的诊断价值及对抗排斥疗效的评判价值。 方法 一．大鼠急性排斥反应动物模型的建立 将大鼠心脏移植动物模型分为实验组和对照组，实验组将Wister大鼠和SD大鼠分别作为供受者，对照组单纯将SD大鼠作为供受者进行心脏移植。在动物模型建立的过程中，先暴露和游离好受体的吻合段血管，再获取供心以缩短移植心冷缺血时间，保留供者的心脏及右上肺，以9/0的无损伤线将其胸主动脉与受者的腹主动脉间断端一侧吻合;开放血管时，要求先开放远心端，近心端要间断开放，同时用手按摩心脏至心脏达到规律而又强有力的搏动，并可见移植心脏的颜色恢复红润，右下肺亦充盈良好，以移植心脏/大鼠存活24小时以上作为手术成功的标准。 二.大鼠心脏移植急性排斥反应过程中穿孔素及颗粒蛋白酶BmRNA的表达 实验组(n=16)与对照组(n=17)术后均未接受抗排斥治疗，于手术前3天及手术后1、3、5、7、9、n天采集外周血，同时进行活组织病理检查，应用荧光定量PCR方法，测定穿孔素及颗粒蛋白酶B mRNA的表达水平，组织病理学改变则行常规HE染色，光镜下检查。三.临床资料的观察 对2003年3月~2004年3月期间，在我科行肾移植而临床诊断为急性排斥反应的32例患者进行了动态观察，其中男性19例(平均年龄48.7岁)，女性13例(平均年龄453岁)，于手术后第1天，及临床诊断为急性排斥反应而给予抗排斥治疗期的1、3、5、7、9天采集外周血，应用荧光定量PCR方法，测定穿孔素及颗粒蛋白酶B mRNA的表达水平，与病人血肌配的变化相比较，观察它们的相关性。结果一动物模型的建立 实验组进行20例心脏移植，成功16只，动脉吻合口出血2只，心脏复跳失败1只，吻合口狭窄1只;对照组进行20例心脏移植，成功17只，2只死于吻合口出血，1只死于吻合口狭窄。实验组手术成功率为80%，对照组为85%(P>0.05)。 二.大鼠心脏移植急性排斥反应过程中穿孔素及颗粒蛋白酶BmRNA的表达 实验组于移植后24hP及GB mRNA的表达开始上调，术后72h的表达明显增加(p<0.001)，术后3一5d达峰值，7一lld维持高水平;病理学检查显示，移植后24h，心肌组织无明显的病理学变化，术后3一sd，出现I级的病理学变化;7一lld则出现m一W级的病理改变;而对照组穿孔素及颗粒蛋白酶B InRNA的表达及病理检查在同期的观察过程中均没有明显的变化(p>0.05)。 三.肾移植术后患急性排斥反应病人的穿孔素及颗粒蛋白酶BmRNA的表达 32例肾移植患者发生排斥反应后，穿孔素及颗粒蛋白酶B mRNA的表达水平，与术后未发生排斥反应时相比有明显升高(p<0.001)，经过有效的抗排斥治疗，则会出现很快下降的趋势，并逐渐接近正常水平，与血肌配的下降一致，但早于血肌配的下降。结论一大鼠急性排斥反应动物模型的建立 1.先暴露并游离好受体血管吻合段，再获取供心，可以缩短移植心冷缺血时间。边灌注边获取的方法利于快速而又完整的获取供心。在切取和植入的过程中一定要注意低温保护心脏。 4.利用腹主动脉段进行移植，使手术方便易行。左心做功的大鼠腹部心脏移植模型简单、安全、实用，因其左心参与循环而使血流动力学更接近生理状态，是进行心脏移植及血流动力学研究的理想动物模型。 二.同种异型大鼠心脏移植的急性排斥反应过程中，外周血淋巴细胞的穿孔素及颗粒蛋白酶B mRNA的表达水平，术后呈现递增的趋势，于3一sd达到高峰，其变化程度早于病理改变的程度，可以作为急性排斥反应的监测指标。 三.利用荧光定量PCR测定外周血中穿孔素及颗粒蛋白酶B mRNA的表达，可以预测肾移植术后急性排斥反应的发生及抗排斥反应治疗的效果。