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猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV),属于尼多病毒目冠状病毒科Alpha病毒亚群,是一种具有囊膜结构的单股正链RNA病毒,可以在猪的小肠上皮黏膜细胞胞浆中进行复制,临床上可以引起猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis,TGE)。目前各猪场对TGE的防治均以免疫接种为主,但由于TGEV作为RNA病毒具有高突变、高重组的特点,使得现阶段使用的TGEV疫苗难以对猪群起到较好的免疫保护作用。因此对当前临床流行的TGEV分离鉴定及其生物学特性研究是研制新型高效疫苗的基础。本文对从齐齐哈尔市某猪场获得的疑似感染TGEV病猪剖检后的小肠病料进行无菌处理后,在猪睾丸细胞(ST)上进行盲传培养鉴定,观察到典型的特征性细胞病变(CPE)。根据RT-PCR和间接免疫荧光实验证实成功分离了两株TGEV流行毒株,将其分别命名为HE-1和HE-4。电子显微镜观察病毒形态,在胞浆中可以看到具有典型冠状病毒形态特点的病毒粒子。根据Gen Bank数据库中报道的TGEV-HX序列,设计包含TGEV全基因组序列的13对交叉引物对TGEV HE-1、HE-4分离株结构蛋白和非结构蛋白基因进行扩增;利用RACE试剂盒,对病毒基因组非编码区5’UTR和3’UTR通过RT-PCR技术得到了相应序列;对测序获得的结果进行序列拼接获得病毒的全基因组序列。生物信息学分析结果显示:TGEV分离株HE-1、HE-4与国内外目前报道的已上传全基因组序列基因信息的TGEV病毒分离株具有较高的同源性,与国内分离株AYU、HX、WH-1和国外分离株Purdue P115同源关系最高,达到99.8%,与变异株PRCV-ISU-1同源性最低为97.4%。建立了基于TGEV全基因组和不同单个基因的系统发育进化树,其中TGEV全基因组进化树结果显示:分离株HE-1和HE-4都和TGEV Purdue群而不是与TGEV Miller群保持更近的亲缘关系。TGEV各毒株的不同基因进化树的进化分支情况也有所差异,这可能是与不同基因在进化过程中的保守性和变异情况有关。TGEV分离株HE-1、HE-4全基因组均由28 580个核苷酸组成,具有典型冠状病毒TGEV基因序列特征;5’和3’非编码区相对保守,在非结构基因ORF1a、ORF1b、ORF3a、ORF3b、ORF7未发生插入和缺失;在分别负责编码结构蛋白如膜结合蛋白(M)、核蛋白(N)和小膜蛋白(E)的基因上虽无插入和缺失现象发生,但是其分别有4、2和1个氨基酸发生突变。但在编码纤突蛋白(S)的氨基酸比对中发现,与TGEV经典毒株Purdue株相比,分离株在562-564 aa处缺少NNT糖基化位点,与TS株相比在375-377 aa处缺少NDT糖基化位点;同时,HE-4株在影响抗原位点D位点的385 aa处发生突变(S-N)。TGEV黑龙江地区流行毒株HE-1和HE-4的成功分离与全基因组测序,为TGEV的深入研究和相关高效新型疫苗的开发奠定了理论和物质基础。