背景：骨质疏松症是以骨量的减少和骨微结构的破坏为特征的一种全身性代谢性骨病,会导致骨脆性增加,造成患者骨折发生率增高。随着我国社会老龄化进程的加剧,骨质疏松症的发病率逐年升高,严重影响着老年人的身体健康与生活质量。在我国,对于骨质疏松症的治疗以抗骨质吸收为主,无法达到增加骨量的目的。2002年美国FDA批准低剂量PTH间断性皮下注射治疗骨质疏松,2010年PTH被批准进入中国市场,治疗女性绝经后重度骨质疏松。研究证实,甲状旁腺素增加骨量效果明显,对于骨质疏松及其导致的骨折、关节假体松动以及二磷酸盐长期使用所引起的非典型骨折等均具有明显的疗效。在临床治疗的评价中,甲状旁腺素(商用名：特立帕肽)被证实具有可靠的抗骨质疏松作用。甲状旁腺素具有促骨质形成、增加骨密度和降低骨折发生风险等明显的作用,但其具有间断小剂量促进骨形成,连续大剂量促进骨吸收的双向调节作用。这种特殊的双重调节作用导致PTH的疗效并不十分理想。而不同剂量所造成的不同效应跟甲状旁腺素结合受体导致不同信号通路被激活有关。目前研究显示,PTH的生物学作用主要是通过三条信号通路的激活：分别是cAMP/PKA、 PLC/PKC和nonPLC/PKC通路。其中,PTH主要通过cAMP/PKA这一通路对骨的代谢起调节作用,但这种调节是双向的,与应用的剂量相关。PLC/PKC信号通路对PTH的破骨作用有辅助增强的功能,而nonPLC/PKC通路能够特异性对某些部位进行成骨调节作用。参与介导PTH/nonPLC/PKC的亚信号通路还没有清晰的界定,但是相关的研究提示存在多因子参与、多亚信号通路介导的可能。1)PTH(1-34)的C端结构,包括PTH(3-34)和PTH(29-34),介导nonPLC/PKC信号途径,具体的信号介导机制需要深入研究。2)不能排除cAMP/PKA参与介导nonPLC/PKC的可能。最近我们的研究发现cAMP/PKA选择性PTH模拟肽,GlylArgl9hPTH(1-28)(即G1R19(1-28)),可激活PKC,提示cAMP/PKA可能部分参与PTH/nonPLC/PKC信号途径。3)Rho A/Rho Kinase/PLD可能介导nonPLC/PKC。通过对这三条通路的研究,在甲状旁腺素基本结构基础之上,研究具有更强的成骨作用、结构更短的模拟肽是研究的重要方向之一。在甲状旁腺素信号通路的研究中,cAMP和PLC的研究相对比较成熟,PKC的研究相对困难,主要是因为缺乏灵敏快捷地检测PKC活化的技术。以往对于PKC激活的检测方法主要包括PKC分子细胞内转位,PKC分子局部氨酸残基的磷酸化等,这些方法只能间接检测PKC的活性,而且需要借助放射性同位素的作用,需要较高的实验条件和技术,而且放免法背景高,灵敏度低,不利于研究的进行。荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)技术,是指两个荧光发色基团在足够靠近时,当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态,在该电子回到基态前,通过偶极子相互作用,实现了能量向邻近的受体分子转移(即发生能量共振转移),这种技术近些年被广泛的用来研究信号通路,其对分子的活化具有直接灵敏的反映。Newton等人最先报道了检测PKC活化的FRET系统,即在青色荧光蛋白(CFP)和黄色荧光蛋白(YFP)之间插入了特异性PKC作用底物和FHA2磷酸化肽段的结合域,构成了CKAR分子。转染了此质粒的细胞可以表达出CKAR报告分子,通过共聚焦显微镜分析两种荧光强度的相对改变,即比较两者之间的比值变化(C/Y),可以作为判断刺激物是否激活PKC的证据。采用这个实验模型联合构建的甲状旁腺素稳定转染细胞系,通过改变甲状旁腺素的氨基酸的排列结构和受体的信号通路表达,研究不同通路及分子对于PKC活化的作用及强度,更好的研究并优化PTH模拟肽的作用。目的：构建目的质粒pcDNA3.1(+)-PTHR及pcDNA3.1(+)-DSEL。通过G418压力筛选法构建两种稳定转染细胞系并进行鉴定。通过前期建立的FRET技术及共聚焦显微镜检测FRET体系在稳定转染细胞系中的表达是否可以满足PKC活化的检测。通过不同的抑制剂与多种甲状旁腺素模拟肽,探究PKC活化所需要的条件,探究可能参与nonPLC/PKC通路的途径,以及各条通路之间的关系。最后通过RT-PCR检测与这些通路相关的基因的表达,并验证实验结果。方法：通过碱裂解法从扩增的含有目的质粒的大肠杆菌中提取目的质粒,并通过质粒提取试剂盒纯化。紫外分光光度计测量质粒浓度及纯度。通过双酶切、胶回收方法分别纯化目的片段(PTHR、DSEL基因片段)和质粒pcDNA3.1(+),二者分别由DNA限制性内切酶EcoRI与NotI双酶切,经T4DNA Ligase连接的方法将PTHR和DSEL基因克隆到质粒表达载体pcDNA3.1(+)中,采用基因测序及DNA限制性内切酶双酶切方法鉴定。运用脂质体转染法将含有目的基因PTHR及DSEL的重构质粒转染到HEK293细胞中,再根据G418抗性筛选的方法建立稳定转染细胞系,通过RT-PCR及ELISA等方法鉴定,确认稳转细胞构建成功。在共聚焦显微镜下观察FRET体系在稳定转染细胞系中对TPA、8Br-cAMP及PTH(1-34)等刺激的反应,确认稳定转染细胞系是否满足FRET体系的激活条件,并与前期的实验结果进行对照。将CKAR质粒转染稳定转染细胞,培养72h。在共聚焦显微镜下观察PTH(1-34)、G1R19(1-34)及G1R19(1-28)引起CKAR分子发生的FRET改变,并通过加入不同的信号通路阻滞剂及不同信号通路模拟肽改变信号通路,来观察FRET效率以及青色荧光与黄色荧光强度的比值(C/Y)是否改变以及改变的强度,判断三种甲状旁腺素模拟肽对PKC的激活情况,以此判断nonPLC/PKC通路可能的组成情况。根据FRET的实验结果,通过甲状旁腺素模拟肽和阻滞剂刺激MC3T3-E1细胞,采用RT-PCR分析,对以上的实验结果进行深入的探讨。结果：提取、纯化目的质粒,紫外分光光度计测量质粒的浓度和纯度。采用双酶切的方法酶切pcDNA3.1(+)和含鼠PTHR及DSEL的质粒,琼脂糖凝胶电泳显像,可见在5428bp与1980bp左右处分别有代表的pcDNA3.1(+)质粒和PTHR、 DSEL基因的线性化片段,并回收。通过T4DNA Ligase将PTHR、DSEL基因片段分别插入到pcDNA3.1(+)质粒的EcoRI与Not I位点之间,重组质粒构建成功。转化E. coli DH5a感受态大肠杆菌。扩菌培养,抽提质粒进行酶切鉴定及测序鉴定。琼脂糖凝胶电泳显示在5428bp处和1980bp处各有1条亮带,与质粒载体及目的基因大小相符,且双向测序结果与GenBank(X78936.1)报道的PTHR序列相符,表明小鼠甲状旁腺素受体重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-PTHR、pcDNA3.1(+)-DSEL构建成功。通过脂质体转染联合G418压力筛选法建立PTHR、DSEL稳定转染细胞系,并通过PCR扩增及ELISA鉴定。ELISA检测结果显示PTHR稳转细胞胞内的PLC表达量比单纯转染pcDNA3.1(+)质粒的HEK293细胞高2倍左右,而DSEL稳转细胞胞内的PLC表达量与单纯转染pcDNA3.1(+)质粒的HEK293细胞基本相同。cAMP的测定与以上过程相似,ELISA检测结果表明PTHR稳转细胞胞内的cAMP表达量与DSEL稳转细胞基本相同,均高于单纯转染pcDNA3.1(+)质粒的普通HEK293细胞的5倍左右。证明稳转细胞能够稳定高表达PLC与cAMP。RT-PCR结果显示,采用特异性引物可从PTHR、DSEL转基因细胞中扩增出大约2000bp的目的片段,而pcDNA3.1(+)稳定转染细胞无相应特异性片段呈现。综上所述,我们成功得到稳定高表达小鼠PTHR、DSEL的HEK293稳定转染细胞模型。将CKAR质粒转染进PTHR、DSEL稳转细胞,培养72小时后,用不同的甲状旁腺素模拟肽刺激,在共聚焦显微镜下观察FRET的变化情况。在共聚焦显微镜下观察FRET体系在稳定转染细胞系中对TPA、8Br-cAMP及PTH(1-34)等刺激的反应,均得到了明显的FRET反应,确认稳定转染细胞系满足FRET体系的激活条件,并得到了与前期实验一致的结果。在转染CKAR质粒并稳定表达PTHR或DSEL受体的HEK293细胞中,100nmol/L的G1R19(1-34)、1μmol/L的G1R19(1-28)可以在转染PTHR和DSEL稳定转染细胞系中激活PKC。当加入10μM/L的Rp-cAMP阻滞1.5小时后,重复G1R19(1-34)和G1R19(1-28)的刺激,G1R19(1-34)仍可以引起C/Y明显增加,但G1R19(1-28)未能引起C/Y增加。加入5ng/ml的活性PKA(α+β)后,1μmol/L的G1R19(1-28)再次引起C/Y明显增加。不同甲状旁腺素模拟肽刺激MC3T3-E1细胞,PCR定量分析采用2-ΔΔCt法。在G1R19(1-28)的刺激下ALP与CITED1的表达分别增加了4倍与11倍；在Go6983处理后,ALP的表达被阻滞,CITED1的表达下调。G1R19(1-28)降低了OSX的表达,在Go6983处理后,其表达更低。PKC的阻滞剂应用前后,NR4a2的表达从2倍增加到6倍。BSP的表达没有改变。通过Rp-cAMP和G1R19(1-28)、G1R19(1-34)的共同刺激,显示与PTH(29-34)相关的基因。ALP的表达不能够被G1R19(1-28)和Rp-cAMP的联合作用所改变,但却在G1R19(1-34)和Rp-cAMP联合作用下明显的提升,此结果被Go6983所逆转。CITED1的表达在G1R19(1-28)和G1R19(1-34)的刺激下均增加,但G1R19(1-34)的效应被Go6983下调了。Rp-cAMP预处理后,G1R19(1-28)及G1R19(1-34)都造成OPG的表达降低,但是这两种不同结果都被Go6983所减弱。BSP、OPN和OSX的表达水平在G1R19(1-28)和G1R19(1-34)两组中是相似的。结论：1.成功构建了pcDNA3.1(+)-PTHR及pcDNA3.1(+)-DSEL质粒。通过脂质体转染的方法转染HEK293细胞,稳定转染细胞通过PCR及ELISA验证后证明构建成功。CKAR质粒可以在稳定转染细胞内成功表达并且具备检测PKC活化的功能,再次证明了我们前期构建的FRET模型是一种灵敏可靠的PKC活性检测模型,构建的稳定转染细胞对于甲状旁腺素受体的表达符合试验的要求,为甲状旁腺素的进一步研究提供了良好的实验模型。2.目前认为PTH(1-34)具备激活cAMP/PKA、PLC/PKC和nonPLC/PKC三条通路的功能,突变后的G1R19(1-34)无法激活PLC/PKC通路；G1R19(1-28)能够激活cAMP/PKA通路,不能激活PLC/PKC通路,其是否参与nonPLC/PKC通路激活尚存争议。PTHR1是甲状旁腺素的野生型受体,其与PTH结合后激活三个信号通路,而DSEL是人工合成的甲状旁腺素受体突变型受体,其与PTH结合后,不能激活PLC/PKC通路。本实验结果显示,G1R19(1-28)可通过PLC非依赖途径激活PKC,可能通过两种不同的机制：一种是PKA依赖的,与PTH(1-28)相关；另一种是PKA非依赖性的,与PTH(29-34)相关。这些通路的生物学功能还有待进一步研究。3.PTH(29-34)区域与nonPLC/PKC通路是相关的,并且这条通路不依赖于cAMP/PKA。我们发现G1R19(1-28)激活PKC依赖cAMP/PKA通路,据此为依据,我们消除掉MC3T3-E1细胞的cAMP/PKA通路及PKA依赖性PKC信号通路的影响,比较G1R19(1-28)和G1R19(1-34)对于基因表达的调控作用。ALP、CITED1和OPG的表达在G1R19(1-28)和G1R19(1-34)两种肽中不同。G1R19(1-28)和G1R19(1-34)所调控的基因的不同被PKC抑制剂明显的钝化。通过PCR的检测,发现了与PKA和PKC表达相关的部分基因,为以后的模拟肽的设计和检测提供了灵敏的基因水平的检测指标,同时也证明了PKA非依赖的nonPLC/PKC与PTH(29-34)区域有关。4.以往的研究认为PKA是PTH成骨的主要信号通路,我们的研究发现了PKC与PKA信号通路的交叉作用,将引起人们对PTH成骨信号通路的再认识。G1R19(1-28)激活PKC的信号通路及其信号分子的组成仍有待进一步研究,本研究结果进一步丰富了PTH对骨组织作用的信号通路理论,为进一步研究提供了理论基础和实验模型,也为甲状旁腺激素对骨质疏松的治疗提供了新的方向。