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背景:骨关节炎（OA）是一种以软骨细胞肥大性变、软骨基质的降解、关节炎性浸润、骨刺形成及进行性软骨丢失为特点的骨关节相关疾病。据世界卫生组织统计,60岁以上的人群中,有15%的群体受该疾病困扰,随着人口老龄化的加剧,该病发病率仍在上升。该病病因复杂,公认的病因有年龄、关节的过度磨损、创伤、代谢综合征等。关节内环境稳定由多种信号通路的相互作用调节,软骨细胞表型的维持在这一过程中起主导作用。在正常情况下,关节软骨细胞处于增生前阶段,再生能力低,代谢活性低,软骨细胞和细胞外基质之间存在微妙的平衡,周转率最低。在骨性关节炎中,软骨细胞开始肥大分化,并表达诱导软骨损伤的X型胶原蛋白以及机制金属蛋白降解酶（COLX和MMPs）等肥大标记物,软骨细胞的代谢平衡被打破,随着软骨基质的降解,可观察到一系列软骨破坏事件。因为参与OA发病机制的确切分子机制尚不清楚,目前除了全关节置换手术外,没有有效的干预措施来减缓OA的进展或延缓软骨的不可逆降解,治疗手段仍以终末期手术为主,昂贵的手术费用及并发症给社会和家庭带来沉重的经济和精神负担。因此研究骨关节炎发病机制,并探索骨关节炎的治疗策略是一个重要的社会命题。骨钙素（Osteocalcin,OCN）,是骨中含量最丰富的非胶原蛋白,常被作为骨代谢的标志物,该蛋白有三个羧基位点,当三个羧基位点完全羧化时（c OCN）有很强的钙结合性,与钙结合后主要沉积在骨基质中。当机体在一定条件下,该蛋白会发生脱羧改变,这种羧化不全的骨钙素蛋白（ucOCN）,随着OCN的脱羧改变,蛋白结构也发生相应变化,与钙离子的亲和力降低,并从骨基质游离,进入血液发挥内分泌作用。近些年的研究表明,c OCN和ucOCN虽然是同一种蛋白的两种形式,但是发挥着完全不同的功能。本研究以小鼠作为研究对象,明确了OCN对软骨细胞的作用是细胞内OCN和细胞外OCN的综合作用,并且ucOCN能够显著抑制小鼠软骨细胞的肥大变性,同时进一步研究了ucOCN抑制软骨细胞肥大的相关机制,有望为关节炎的预防和治疗以及药物开发提供新线索。具体研究分以下三个方面进行详细阐述:第一部分:OCN敲除对小鼠软骨细胞表型及关节炎表型的影响目的:明确OCN敲除后小鼠软骨发育是否异常,是否发生肥大变性,并进一步明确OCN敲除在小鼠骨关节炎模型中的影响。材料和方法:1,小鼠:C57BL/6N小鼠,购买自北京维通利华公司;OCN敲除C57BL/6N小鼠,购买自赛业生物,后于北京军科院动物中心繁殖。3,主要方法:小鼠软骨细胞提取、小鼠内侧半月板不稳术（DMM模型）、QRT-RCT、Western-blot、番红固率染色、免疫组化,酶联免疫吸附试验,软骨细胞颗粒培养。实验结果:1,分离培养的软骨细胞状态良好呈现多边形。2,OCN敲除小鼠敲除效率良好。3,OCN敲除后新生鼠生长板软和成年鼠软骨细胞中均呈现肥大倾向。4,在体外细胞实验中,OCN敲除小鼠来源的软骨细胞展示出更明显的肥大表型。5,OCN敲除小鼠与WT组对比关节炎进展没有加快。6,炎症环境下体外培养软骨细胞中OCN仍然展示出保护作用结论:在正常小鼠中OCN可以抑制软骨细胞肥大变性。在骨关节炎OCN的保护作用减弱,表现为OCN敲除小鼠与WT小鼠相比并没有展示出更重的关节炎。在关节炎进展中细胞内的OCN和关节炎呈现出正相关而细胞外的ucOCN与关节炎进展展现出负相关,提示他们可能在关节炎中发挥不同的作用。第二部分:ucOCN能够抑制软骨肥大变性,并延缓关节炎进展目的:明确ucOCN在软骨细胞及骨关节炎中的作用。材料和方法:1,小鼠:C57BL/6N小鼠,购买自北京维通利华公司;OCN敲除C57BL/6N小鼠,购买自赛业生物,后于北京军科院动物中心繁殖。2,OCN过表达病毒,吉凯生物。3,主要方法:小鼠软骨细胞提取、小鼠内侧半月板不稳术（DMM模型）、QRT-RCT、Western-blot、番红固率染色、免疫组化,免疫荧光实验、酶联免疫吸附试验。实验结果:1,OCN过表达效率良好,过表达后软骨细胞内MMP13和COL10a1表达增高。2,软骨细胞具有产生ucOCN的能力,中和上清中的ucOCN,软骨细胞有更明显的肥大倾向。3,在炎症环境下软骨细胞产生ucOCN能力下降,在上清中补充ucOCN能够显著抑制软骨细胞肥大变性,4,ucOCN能够抑制OCN基因敲除小鼠软细胞的肥大变性在一定的浓度范围内,ucOCN能够有效的抑制OCN-/-小鼠软骨细胞肥大变性。5,ucOCN能够抑制小鼠骨关节炎进展结论:在软骨细胞中细胞内的OCN和细胞外的脱羧OCN展现出综合作用,细胞内OCN促进软骨细胞肥大,细胞外ucOCN抑制软骨细胞肥大并能够延缓关节炎进展。第三部分:ucOCN调控软骨细胞的机制研究目的:明确ucOCN在软骨细胞中受体及下游的作用机制。材料和方法:1,小鼠:C57BL/6N小鼠,购买自北京维通利华公司.2,主要方法:小鼠软骨细胞提取、小鼠内侧半月板不稳术（DMM模型）、QRT-RCT、Western-blot、番红固率染色、免疫组化,免疫共沉淀实验,明胶酶解实验。实验结果:1,Gprc6a介导ucOCN在软骨细胞中的功能。2,RNA测序提示Hif-1a可能为OCN-Gprc6a下游的通路。3,体外实验证明,ucOCN正性调节Hif-1α通路,增加Timp3的表达,同时抑制Akt-Mtor通路增加自噬相关蛋白的表达。4,ucOCN增加软骨细胞内ATP的含量。体内实验证明Hif-1α在关节炎中受到ucOCN的正性调控。结论:本部分实验我们证实了G蛋白欧联受体-Gprc6a介导了OCN在软骨中的作用,并通过体内体外实验证实ucOCN抑制软骨细胞肥大并延缓关节炎的进展是通过Gprc6a/Hif-1α信号级联增加Timp3的表达,抑制AKT-Mtor通路实现的