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研究目的:本课题研究了 CPNE 1在非小细胞肺癌组织中的表达及与患者临床病理参数的相关性。分别从体外细胞水平和体内动物水平探讨microRNA-335-5p通过靶向CPNE 1抑制非小细胞肺癌细胞增殖和转移,同时对相关机制作进一步研究。研究方法:1、通过免疫组化(IHC)和实时荧光定量PCR方法检测60例非小细胞肺癌和配对癌旁组织标本中CPNE 1的表达情况;分析其与临床资料的相关性。2、应用CCK-8法、克隆形成实验、流式细胞术、划痕及Transwell实验分别检测干扰和过表达CPNE 1对非小细胞肺癌细胞增殖和转移功能的影响;Western Blot方法检测CPNE 1下游相关增殖、转移信号蛋白水平变化。3、采用生物信息学手段预测CPNE 1上游潜在的microRNAs,并结合组织芯片结果筛选microRNA-335-5p为研究对象;双荧光素酶实验验证microRNA-335-5p与CPNE 1的靶向调控作用;通过CCK-8法、克隆形成实验、流式细胞术、划痕及Transwell实验分别验证microRNA-335-5p对非小细胞肺癌细胞增殖和转移功能的影响;Western Blot方法检测microRNA-335-5p对下游相关增殖、转移信号蛋白水平变化。4、通过构建裸鼠皮下成瘤模型,观察过表达CPNE 1对非小细胞肺癌成瘤能力的影响。研究结果:1、CPNE 1在非小细胞肺癌组织中表达高于癌旁组织,差异具有统计学意义(P<0.05);分层分析发现CPNE 1的表达与患者的性别、年龄、吸烟史、病理类型、临床分期之间无明显相关性(P>0.05),但在淋巴结转移患者组织中表达高于非淋巴结转移患者,差异有统计学意义(P<0.05)。2、在A549和H1299肺癌细胞株中分别干扰和过表达CPNE 1后,肺癌细胞的增殖和转移能力分别减弱或增强;流式细胞术结果提示CPNE 1主要影响细胞周期,而对细胞凋亡无明显影响;Western Blot结果提示p-EGFR及下游的p-FAK、p-SRC、p-AKT、p-ERK、Cyclin D1及Snail、N-cadherin、MMP9与CPNE 1蛋白变化水平一致,干扰CPNE 1表达可以降低EGF刺激诱导的p-EGFR、p-FAK、p-SRC、p-AKT、p-ERK蛋白上调;Co-IP结果提示CPNE 1可以通过与EGFR结合,从而激活EGFR及其下游的信号通路介导肺癌细胞增殖和转移,两者之间存在共表达。3、microRNA-335-5p mRNA在非小细胞肺癌中表达低于癌旁组织,差异具有统计学意义(P<0.01);分层分析发现microRNA-335-5pmRNA的表达与患者的年龄、性别、吸烟史、病理类型以及临床分期之间无明显关系(P>0.05),但在淋巴结转移患者组织中表达低于非淋巴结转移患者,差异有统计学意义(P<0.05);双荧光素酶实验证实microRNA-335-5p可以靶向调控CPNE 1的表达,A549及H1299肺癌细胞株转染 microRNA-335-5p mimics 后microRNA-335-5p mRNA 表达显著上调,同时CPNE 1 mRNA和蛋白表达均明显下调,进一步验证双荧光素酶的结果;与miR-NC组相比,转染上调microRNA-335-5p mRNA后可以抑制细胞的增殖和转移能力,同时p-EGFR及其下游的p-FAK、p-SRC、p-AKT、p-ERK、Cyclin D1及Snail、N-cadherin、MMP9蛋白表达下降。4、通过对裸鼠瘤体观察发现:CPNE 1过表达组接种后第22天可见肿瘤生长,而PLVX组在接种后第26天才出现肉眼可见的肿瘤;CPNE 1过表达组移植瘤生长明显加快,而PLVX组移植瘤生长缓慢,体积明显比对照组小;待裸鼠瘤体体积达到1000cm3处死裸鼠,完整取出瘤体后拍照称重,平均重量分别为:CPNE 1过表达组0.494g,PLVX组0.293g,CPNE 1过表达组瘤体重量及肉眼体积明显高于PLVX组,差异有统计学意义(P<0.05);免疫组化结果显示,过表达组CPNE 1蛋白表达水平较对照组明显上调。研究结论:1、CPNE1在非小细胞肺癌组织中高表达,且在淋巴结转移患者组织中表达高于非淋巴结转移患者;2、CPNE 1可以通过EGFR及其下游信号通路促进非小细胞肺癌细胞的增殖和转移;II3、microRNA-335-5p通过靶向调控CPNE 1抑制非小细胞肺癌细胞的增殖和转移,与EGFR及其下游信号通路有关;4、CPNE 1在体内可以促进非小细胞肺癌的增殖。