据统计,吸入性肺损伤可使烧伤病人的整体死亡率增加20%以上。虽然随着科学的发展,烧伤的整体救治水平有了很大的进步,但对吸入性肺损伤而言,目前国内外临床救治仍停留在被动的对症治疗水平,如开放气道(气管切开),吸氧,机械通气等;国内外对吸入性肺损伤发展的实验研究主要有以下两方面:1、药物治疗机制;2、细胞修复机制,尚缺乏主动的特异性治疗方法,表明我们至今对吸入性肺损伤的认识还较为肤浅,究其原因是对其发病及病理变化机制还未真正阐明。因此,研究吸入性肺损伤的确切发病机制及有效的干预措施实属必要。临床研究和动物实验表明:炎性细胞浸润、大量自由基生成、促炎症介质在肺组织过度表达以及炎症信号通路的激活是吸入肺损伤的早期重要的致病机制,Nuclear factorκB(NF-κB)信号通路是其中最为关键的一条,其通过多种途径介导吸入性肺损伤的病理生理过程。因此,抑制NF-κB信号通路的活化对于阻断吸入肺损伤的致病机制、从而减轻其临床症状、逆转其病理生理过程具有积极的意义。本实验组前期已证实NF-κB信号通路中有多个微小RNA(microRNAs,miRNAs)启动子结合位点,应用mi RNAs靶点定向调控炎症因子为临床治疗吸入性肺损伤开辟了新途径。MiRNAs是RNA家族成员之一,真核细胞中一类由内源性非蛋白编码的单链小分子RNA,长度约18-25个核苷酸,参与转录后的基因调控。miRNA来源于初级转录产物(pri-miRNA),在细胞核内经核糖核酸内切酶III(Drosha)进行第一步剪切后,形成长度约60-80个碱基的含发卡结构的前体miRNA(pre-miRNA)。然后通过依赖Exportin-5的转运机制,将pre-miRNA转运至细胞质内,随后在另一类核糖核酸内切酶III(Dicer)的第二次剪切作用下,加工形成约为18-25个碱基长度的成熟miRNA。miRNA与靶mRNA 3′-非翻译区结合在转录后降解,或者与之部分结合在翻译水平抑制蛋白合成,从而通过调节基因表达,在细胞增殖、分化、代谢、凋亡、胚胎发育、病毒感染、肿瘤发生以及免疫应答等多种生物学过程中起着至关重要的作用。细胞接收外源或内源压力信号后的一种早期反应表现为mirnas的表达,参与调控机体免疫应答。但目前关于mirnas在吸入性肺损伤的作用还鲜有报道。本课题组前期研究发现在h.pylori感染胃上皮细胞模型中表明了mir-146a和mir-155基因的启动子序列中含有nf-κb结合位点,证实了炎症感染诱导mir-146a和mir-155的高表达受到nf-κb信号通路调节。因此,我们根据前期实验,在吸入性肺损伤模型中,寻找mir-146a和mir-155新的靶基因,并验证其在吸入性肺损伤中的作用机制。方法mir-146a、mir-155在烟雾刺激吸入性肺损伤中的功能研究。1、靶基因的预测:根据生物信息学targetscan、miranda、pictar三大靶标分析软件预测mir-146a、mir-155靶基因,通过查阅文献并结合靶基因功能筛选与nf-κb炎性关系更贴近的基因。2、荧光素酶实验:鉴定mir-146a、mir-155分别与靶基因结合作用。3、real-timepcr实验:细胞模型:①检测转染mir-146a、mir-155在a549细胞中靶基因的rna的表达②检测烟雾颗粒刺激转染mir-146a、mir-155a549细胞中靶基因及炎症因子rna的表达。动物模型:检测烟雾刺激小鼠转染mir-146a、mir-155肺组织中靶基因及炎症因子rna的表达。4、westernblot实验:检测细胞模型、动物模型靶基因蛋白、环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,cox-2)的表达。5、elisa实验:检测细胞模型、动物模型炎症因子白细胞介素8(interleukin-8,il-8)、生长相关癌基因α(growth-relatedoncogene-α,GRO-α)、单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic peptide-1,MCP-1)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)、白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)的表达。本研究结果表明:1、miR-146a和miR-155靶基因的预测及鉴定。①利用TargetScan、Miranda、PicTar三大靶标分析软件预测到miR-146a的靶基因:Fas相关因子2(Fas associated factor 2,FAF-2)、Notch2;mi R-155的靶基因:髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)。②构建含有作用靶点的荧光素酶报告载体,证实了miR-146a和miR-155能与靶基因的3′-UTR结合;实时定量PCR结果表明,miR-146a可通过降解FAF-2、Notch-2的mRNA的表达,miR-155可抑制MyD88的mRNA表达。2、miR-146a和miR-155在吸入性肺损伤中功能鉴定通过细胞、动物实验过表达miR-146a、miR-155后,利用实时定量PCR和Western blot证实了miR-146a和miR-155能与靶基因的3′-UTR结合,能够减少烟雾刺激吸入性肺损伤引起的炎症反应关键酶COX-2和炎症因子IL-8、GRO-α、MCP-1、TNF-α、IL-1β的表达(P<0.05),证明mi R-146a和miR-155在吸入性肺损伤炎症反应中起到调控作用。结论:1、预测并验证了miR-146a和mi R-155在小鼠肺上皮细胞中的一小部分靶基因,表明mi R-146a和miR-155通过作用于FAF-2、Notch-2、MyD88等在信号转导、炎症反应等过程中发挥重要作用的关键蛋白,参与调控吸入性肺损伤引起的炎症反应。2、miR-146a和miR-155作为一类新的负反馈调节因子,与其靶基因构成全新的基因网络调控,参与吸入性肺损伤中炎症反应的调节过程,这为进一步阐明吸入性肺损伤的免疫调控机制及致病机制研究提供新的方向。