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目的 哺乳动物精子的发生是一个极其复杂精细的过程，支持细胞作为生精小管中唯一的体细胞，不仅起着结构上的支持作用，更发挥着营养和调节的作用。最新进展表明，组蛋白甲基化修饰在基因活性的调节中扮演着重要的角色。组蛋白 H3K4 甲基化由组蛋白甲基转移酶(Histone Methyltransferases, HMTs)介导催化，与基因的转录激活相关。PTIP相关蛋白1（PTIP associated protein 1, PA1）是H3K4甲基转移酶的核心组件，自从2007年被发现以后就一直备受关注，然而PA1在男性生殖系统中的表达及功能仍不清楚。为了探究PA1在男性生殖中的作用，我们首先观察了PA1在小鼠睾丸不同发育阶段的表达和定位；然后通过条件性基因敲除的方法获得了支持细胞特异性Pa1敲除(Sertoli cell specific Pa1 knock out, SC-PA1KO）鼠，并对敲除鼠的生殖表型进行了观察，最后对支持细胞中 Pa1 敲除引起雄性不育的机制进行了初步探索。 方法 1. 选取不同年龄段小鼠，采用逆转录聚合酶链式反应（ Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）、qPCR、免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）染色、免疫荧光双标染色等方法观察PA1在小鼠睾丸发育过程中的表达及定位。 2. 提取鼠尾DNA对SC-PA1KO鼠进行基因型鉴定；选取成年SC-PA1KO鼠和同龄WT鼠，分别按照雌雄比例1:1进行配对合笼，观察6个月，检测小鼠的生育力情况；同时提取小鼠附睾尾部精子，观察Pa1敲除对小鼠精子数量和活力的影响。 3. 对1-8 w不同年龄段SC-PA1KO鼠睾丸进行称重拍照；通过HE染色，观察不同年龄段 SC-PA1KO 鼠睾丸组织形态的改变；通过 IHC 染色标记支持细胞，结合精原细胞的组织学特点，对不同年龄段SC-PA1KO鼠睾丸支持细胞和精原细胞进行计数；利用TUNEL染色观察成年SC-PA1KO鼠睾丸组织有无凋亡；放免法检测成年SC-PA1KO鼠血清FSH、LH和T水平的变化。 4. 通过成年SC-PA1KO鼠尾静脉注射伊文思蓝，观察血睾屏障的完整性；透射电镜观察相邻支持细胞之间紧密连接的结构完整性和支持细胞细胞器的结构变化；分离提纯小鼠原代支持细胞，利用定量逆转录聚合酶链式反应（Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction, qRT-PCR），检测 claudin-11、occludin、gelsolin、testin、collagen、laminin和vimentin等连接蛋白的、生长因子Bmp2和Pdgf-A，内分泌和旁分泌相关因子Abp、Ar、inhibin-B和activin-A，转运蛋白Fabp9、transferrin和cacna1a mRNA的表达变化。 5. 1 w SC-PA1KO鼠腹腔注射人重组BMP2蛋白，然后用HE染色观察BMP2能否逆转Pa1敲除引起的生精小管组织形态的变化。 结果 1. qPCR结果显示，Pa1 mRNA在1 w小鼠睾丸中的表达水平较高，在2 w时达到高峰，随后（4 w）逐渐降低，待8 w后维持在稳定水平。IHC染色和免疫荧光双标染色结果显示，PA1在不同年龄段小鼠睾丸生精小管的各级生精细胞、支持细胞以及间质细胞中均有表达，主要表达于细胞核。 2. 小鼠生殖力检测显示，成年SC-PA1KO鼠配对7对，共产仔鼠0只。小鼠附睾精子计数结果显示，成年SC-PA1KO鼠附睾中仅可见极少数精子，且精子运动能力明显减弱。 3. SC-PA1KO鼠睾丸发育异常，4 w以后睾丸大小和重量均明显小于同龄WT鼠。与同龄WT鼠相比，在2 w之前SC-PA1KO鼠睾丸无明显异常；3 w时生精小管开始发生萎缩；4w开始生精细胞数量有所减少；6w时睾丸发育严重不良，生精小管管壁变薄，管腔变大，生精细胞数量进一步减少并且排列紊乱；到8w时SC-PA1KO鼠生精小管管径显著低于同龄WT鼠，部分生精细胞出现空泡样变。IHC染色细胞计数结果显示，SC-PA1KO鼠睾丸支持细胞数量在24 w之前与WT鼠相比无明显差异；而精原细胞数目则从8 w开始逐渐减少，在24 w时， SC-PA1KO鼠部分生精小管中仅剩支持细胞；在72 w时，生精小管管腔中支持细胞和精原细胞均消失。TUNEL染色结果显示，在8 w SC-PA1KO鼠睾丸中未见凋亡细胞。血清性激素检测结果显示，和WT鼠相比SC-PA1KO鼠血清FSH水平无明显差异，LH异常升高，而T显著降低。 4. 伊文思蓝尾静脉注射后观察组织切片，发现SC-PA1KO鼠血睾屏障完整性受到损伤；透射电镜进一步证实支持细胞间紧密连接结构破坏，支持细胞内线粒体嵴断裂，内膜肿胀，同时伴有粗面内质网肿胀，核糖体数目减少；qRT-PCR结果显示， SC-PA1KO鼠睾丸支持细胞中构成紧密连接的重要分子claudin-11 mRNA水平显著降低，锚定连接重要蛋白testin mRNA水平显著升高；与精原细胞增殖密切相关的Bmp2、和雄激素转运密切相关的Abp以及与睾丸中脂肪酸转运密切相关的Fabp mRNA水平均显著降低。 5. SC-PA1KO鼠腹腔注射BMP2蛋白后生精小管上皮结构紊乱有较大改善，精子数也较SC-PA1KO鼠空白对照组显著增多。 结论 1. PA1在不同年龄段小鼠睾丸中均有表达，广泛表达于各级生精细胞、支持细胞以及间质细胞，主要表达于细胞核。 2. 支持细胞特异性Pa1敲除后小鼠表现为不育，睾丸发育、精子发生以及血清性激素水平均明显异常，提示PA1在雄性生殖中起着关键作用。 3. SC-PA1KO鼠支持细胞中claudin-11、BMP2和FABP9表达降低，提示其可能作为PA1下游分子，其转录受PA1调控；PA1对testin和ABP表达的影响有待进一步探索。BMP2腹腔注射实验结果说明BMP2是PA1下游关键信号分子。