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龋病是口腔常见病、多发病。当龋坏到达牙本质后,致龋菌和/或其毒性产物可以通过牙本质小管进入牙髓腔,导致牙髓炎症。免疫反应和第三期牙本质是牙髓发挥防御和修复能力的主要方式。成牙本质细胞由于具有长的细胞突起深入到牙本质小管,是牙髓牙本质复合体最先接触细菌微生物的细胞,那么成牙本质细胞是否和口腔粘膜上皮细胞一样,具有天然免疫的功能,多年来未见研究报道。TLR9是特异识别包含未甲基化CpG基序的细菌DNA(CpG DNA)的天然免疫受体,在许多组织细胞均可快速激活天然免疫反应,并启动后续的适应性免疫反应,在组织细胞免疫防御反应中发挥重要的作用,目前在抗感染、抗过敏和抗肿瘤治疗中已取得了很大的研究进展。本课题组发现体外培养的成牙本质细胞样细胞表达TLR9,提示TLR9可能介导成牙本质细胞的天然免疫功能。但是对于体内的成牙本质细胞是否表达TLR9、TLR9是否特异识别细菌DNA、TLR9活化后细胞内信号途径以及下游基因表达情况国内外尚未见报道。面对细菌入侵,除了免疫反应,形成第三期牙本质是牙髓发挥防御和修复能力的另一种主要方式。许多研究证实DSPP基因表达产物在牙本质形成和矿化,以及第三期牙本质形成过程中均发挥着关键性的作用。由于在细菌感染导致成牙本质细胞或成牙本质细胞样细胞形成第三期牙本质的过程中伴随DSPP基因表达,那么成牙本质细胞内TLR9信号途径在被细菌DNA活化后是否调控DSPP基因表达国内外尚未见研究报道。综上所述本实验通过分子生物学实验方法对TLR9、DSPP基因进行研究,旨在阐明TLR9介导成牙本质细胞天然免疫反应和调控DSPP基因表达的细胞内信号途径。探讨龋病进展过程中,细菌DNA感染、成牙本质细胞免疫反应、DSPP基因表达与第三期牙本质形成相互之间的联系,对阐明牙髓病病因、牙髓损伤修复的分子机制和DSPP基因表达调控规律有重要意义,为免疫防龋研究和活髓保存治疗提供新的思路和途径。1 TLR9、DSPP在成牙本质细胞和牙髓组织中的表达首先收集小鼠牙髓组织利用组织块抽提RNA方法提取总RNA,反转录,行PCR扩增观察TLR9 mRNA在牙髓组织中的表达;其次从小鼠OLC成牙本质细胞系中提取总RNA,反转录,行PCR扩增观察TLR9 mRNA、DSPP mRNA的表达。1%琼脂糖凝胶电泳显TLR9 mRNA在小鼠牙髓组织中和OLC细胞系中均有显著表达,DSPP mRNA在OLC细胞系中有显著表达。TLR9 mRNA分子量198bp,DSPP mRNA分子量151bp。2 CpG DNA对OLC细胞内TLR9、DSPP基因表达调控6孔板培养OLC细胞,用CpG ODN-A和CpG ODN-B刺激细胞,设置时间梯度为0、3、6、9、12、24小时。提取总RNA,反转录,行PCR扩增和实时定量PCR以观察TLR9 mRNA、DSPP mRNA的表达量变化。1%琼脂糖凝胶电泳结果和实时定量PCR结果显示CpG ODN-A刺激组中TLR9 mRNA、DSPP mRNA表达量无明显变化。CpG ODN-B刺激组中TLR9 mRNA、DSPP mRNA表达量呈现先升高后降低的变化,6小时表达量最高,且6小时组是0小时组的3倍。3参与CpG OND调控DSPP基因的表达的细胞内信号途径三种细胞信号途径抑制剂:ERK信号途径抑制剂,PD98059;p38信号途径抑制剂,SB203580;NF-κB信号途径抑制剂,PDTC。OLC细胞经以上三种抑制剂(浓度为30μmol/L)作用后,加入CpG ODN-B刺激6小时后提取总RNA,实时定量PCR结果显示ERK和NF-κB组DSPP mRNA表达明显降低;p38组中DSPP mRNA表达量无统计学意义。