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周细胞是神经血管单元重要组成部分之一,生理状态下周细胞具有促进血管新生、维持大脑毛细血管稳定性、调控大脑微循环血流等多重功能。脑缺血再灌注发生后,缺血部位脑组织发生缺血级联反应,周细胞被激活并发生收缩,压迫其所附着的毛细血管,造成微循环障碍,导致“无复流”现象发生。本课题基于缺血再灌注后周细胞对毛细血管血流调控作用的改变,利用小鼠全脑缺血再灌注模型,探讨清开灵注射液对脑梗死微循环障碍的治疗作用及机制进行研究。目的(1)证明清开灵注射液对全脑缺血再灌注模型小鼠的大脑保护作用。(2)探究清开灵注射液对脑缺血再灌注后周细胞形态功能的干预以及作用机制的研究。方法(1)清洁级雄性健康C57BL/6小鼠,体重20～25g,随机分为四组:假手术组、模型组、清开灵组、依达拉奉组。其中模型组、清开灵组、依达拉奉组小鼠制备全脑缺血再灌注模型,假手术组仅分离双侧颈动脉而不进行血管夹闭。四组分别在脑缺血再灌注后0、4、12、24小时进行给药。清开灵组腹腔注射用一倍生理盐水稀释后的清开灵注射液(0.1ml/10g),依达拉奉组腹腔注射用三倍生理盐水稀释后的依达拉奉注射液(0.1ml/10g),假手术组和模型组按照在相同时间注射相等体积的生理盐水。在造模后24小时对四组小鼠分别进行神经功能评分;通过HE染色和尼氏染色观察各组小鼠脑组织病理形态改变。观察清开灵注射液对全脑缺血模型小鼠脑组织的保护作用。(2)清洁级雄性健康C57BL/6小鼠,体重20～25g,随机分为四组:假手术组、模型组、清开灵组、依达拉奉组。其中模型组、清开灵组、依达拉奉组小鼠制备全脑缺血再灌注模型,假手术组仅分离双侧颈动脉而不进行血管夹闭。四组分别在脑缺血再灌注后0、4、12、24小时进行给药。清开灵组腹腔注射用一倍生理盐水稀释后的清开灵注射液(0.1ml/10g),依达拉奉组腹腔注射用三倍生理盐水稀释后的依达拉奉注射液(0.1ml/10g),假手术组和模型组按照在相同时间注射相等体积的生理盐水。用免疫荧光染色观察各组小鼠脑组织缺血区域内周细胞形态的改变;用Western-blot法、ELISA法检测各组小鼠脑组织中周细胞标记物α-SMA、PDGFR-β表达量的变化。观察清开灵注射液对缺血再灌注后周细胞形态功能的干预作用。(3)清洁级雄性健康C57BL/6小鼠,体重20～25g,随机分为四组:假手术组、模型组、清开灵组、依达拉奉组。其中模型组、清开灵组、依达拉奉组小鼠制备全脑缺血再灌注模型,假手术组仅分离双侧颈动脉而不进行血管夹闭。四组分别在脑缺血再灌注.后0、4、12、24小时进行给药。清开灵组腹腔注射用一倍生理盐水稀释后的清开灵注射液(0.1ml/10g),依达拉奉组腹腔注射用三倍生理盐水稀释后的依达拉奉注射液(0.1ml/10g),假手术组和模型组按照在相同时间注射相等体积的生理盐水。用Western-blot法、ELISA法检测各组小鼠脑组织中RhoA/ROCK通路中通路蛋白表达量的变化,观察清开灵注射液对缺血再灌注后RhoA/ROCK通路的干预作用。结果(1)神经功能评分:假手术小鼠组无神经功能损伤。模型组小鼠自发活动明显减少,意识明显较差,痛触觉减弱,肢体力量变弱,运动协调性以及平衡能力变差,得分显著低于假手术组(P<0.001);依达拉奉组小鼠、清开灵组小鼠与模型组小鼠相比,自发活动相对较多,意识状态较好,痛触觉、肢体力量、运动协调性以及平衡能力均好于模型组,得分明显高于模型组(P<0.001)。(2)HE染色:假手术组脑组织HE染色均匀,细胞组织结构完整,胞质呈淡粉色,核呈深蓝色、核仁清晰,海马角整齐圆润,神经元饱满。模型组脑组织呈现缺血性损伤,海马角大量椎体细胞硬化萎缩,神经元细胞萎缩坏死。清开灵组脑组织呈现恢复趋势,海马角未见椎体细胞萎缩,神经元坏死程度轻。依达拉奉组偶见神经元坏死,可见坏死个恢复区域。(3)尼氏染色:假手术组切片尼氏小体结构饱满、数量丰富。模型组尼氏小体缺失,神经元细胞呈现空泡样变。清开灵组尼氏体相对饱满,尼氏体数量较模型组多。依达拉奉组尼氏小体存在与消亡参半。(4)双重免疫荧光染色:假手术组周细胞与内皮共定位在毛细血管外侧,血管结构正常。与假手术组相比,模型组周细胞发生收缩,血管受到压迫,变形严重,血管管腔被锁死。依达拉奉组与清开灵组类似,与假手术组相比,周细胞发生了轻微的收缩,对血管造成了一定的压迫,但与模型组相比收缩程度较轻、血管管腔变形不严重。(5)Western-blot法检测周细胞标记物表达量变化:模型组周细胞标志物α-SMA、PDGFR-β表达量明显增加(P<0.001)。而清开灵组与依达拉奉组周细胞标记物α-SMA(P<0.001)、PDGFR-β(P<0.01)的表达明显降低。证明清开灵注射液可有效抑制周细胞激活。(6)ELISA法检测周细胞标记蛋白表达变化:假手术组α-SMA、PDGFR-β表达量最低。与假手术组相比,模型组α-SMA、PDGFR-β表达量明显增加(P<0.001)。与模型组相比,清开灵组α-SMA(P<0.001)、PDGFR-β(P<0.01)表达量明显减少;依达拉奉组α-SMA(P<0.001)、PDGFR-β(P<0.001)表达量明显减少。证明清开灵注射液可有效抑制周细胞激活。(7)Western-blot法检测RHoA/ROCK通路蛋白表达量变化:假手术组通路蛋白RhoA、ROCK、MLC-2表达量最低。与假手术组相比,模型组RhoA、ROCK、MLC-2表达量明显增加(P<0.001)。与模型组相比,清开灵组 RhoA(P<0.001)、ROCK(P<0.001)、MLC-2(P<0.05)表达量明显减少。与模型组相比,依达拉奉组RhoA(P<0.001)、ROCK(P<0.001)、MLC-2(P<0.01)表达量明显减少。说明清开灵注射液可有效抑制该通路的激活。(8)ELISA法检测RHoA/ROCK通路蛋白表达量变化:假手术组通路蛋白RhoA、ROCK、MLC-2表达量最低。与假手术组相比,模型组RhoA、ROCK、MLC-2表达量明显增加(P<0.001)。与模型组相比,清开灵组 RhoA(P<0.01)、ROCK(P<0.001)、MLC-2(P<0.001)表达量明显减少。与模型组相比,依达拉奉组RhoA(P<0.001)、ROCK(P<0.001)、MLC-2(P<0.01)表达量明显减少。说明清开灵注射液可有效抑制该通路的激活。结论(1)清开灵注射液可显著提高全脑缺血再灌注模型小鼠的神经功能评分,改善缺血脑组织病理改变。具有脑组织及神经功能保护作用。(2)清开灵注射液可有效抑制脑缺血再灌注后RhoA/ROCK通路以及周细胞的激活,减轻周细胞对脑内毛细血管的压迫,改善脑缺血再灌注后的微循环障碍。