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研究目的:衰老性肌萎缩症是一种与年龄密切相关的慢性老年性疾病,以骨骼肌质量下降和功能衰退为主要特征。随着全球老龄化社会的到来,罹患衰老性肌萎缩症的老年群体日益增加,由此造成的跌倒和骨折严重影响了老年人的生活质量。因此,明确衰老性肌萎缩症的病理机制具有迫切的社会意义。国内外众多研究发现,在衰老过程中,自噬功能下降或缺陷、凋亡增加、能量代谢下调以及蛋白质合成速率减缓都是导致骨骼肌萎缩的因素。运动,尤其是抗阻运动被认为是延缓衰老性肌萎缩症的有效方式,其作用机制与细胞自噬、凋亡、能量代谢以及蛋白质合成密切相关。近年来的研究发现,miRNAs在衰老性肌萎缩症中扮演着重要角色,其中miR-494的表达在衰老肌细胞中被发现上调,并且运动能够降低miR-494的表达。因此,本实验通过建立SAMP8小鼠快速衰老模型,研究抗阻运动和miR-494在衰老性肌萎缩症中的作用及分子机制,进一步探索运动是否通过抑制miR-494的表达调控衰老性肌萎缩症,以期为预防和治疗该疾病提供理论基础。研究方法:本实验采用6月龄的SAMP8小鼠为研究模型,随机分为5组:P8C组（快速衰老组）、494组（小RNA组）、E组（抗阻运动组）、E+494组（运动+小RNA组）,同月龄SAMR1小鼠作为阴性对照组（R1对照组）,每组各10只。494组和E+494组采用肌肉注射antagomir-494,E组和E+494组进行负重爬梯抗阻运动。干预8周后,收集腓肠肌,称重计算腓肠肌/体重湿重比（GMW/BW）评定骨骼肌萎缩的程度;取部分肌肉样本分别进行RT-qPCR、HE染色、TUNEL染色以及透射电镜,以确定抗阻运动和注射antagomir-494干预后腓肠肌中miR-494的表达变化、骨骼肌横截面积的改变、凋亡细胞的阳性比例以及骨骼肌纤维的超微结构、线粒体形态和自噬体的形成;另取部分肌肉样本进行蛋白质免疫印迹实验检测细胞自噬、凋亡、能量代谢以及蛋白质合成等相关蛋白的表达变化。研究结果:1.腓肠肌湿重比GMW/BW:与R1组相比,8月龄SAMP8小鼠腓肠肌的GMW/BW比值明显下降（p＜0.001）;相反,8周的抗阻运动和注射antagomir-494干预后,GMW/BW比值较P8C组均显著提升（p＜0.01）,联合干预组中GMW/BW比值也明显上调（p＜0.001）,提示抗阻运动和注射antagomir-494均可有效提高快速衰老小鼠GMW/BW的比值,延缓骨骼肌萎缩。2.RT-qPCR:与年轻小鼠相比,衰老小鼠骨骼肌的miR-494的表达显著上调（p＜0.01）;抗阻运动和antagomir-494干预后miR-494的表达较P8C组显著下调（p＜0.05）,表明运动和antagomir-494均能引起衰老骨骼肌细胞中miR-494的表达变化,其中,miR-494拮抗剂对骨骼肌miR-494的抑制最为显著（p＜0.01）。3.组织结构的变化:HE染色结果显示,与R1组相比,P8C组肌纤维排列紊乱,肌肉横截面积缩小（p＜0.001）,肌间隙变宽。对比P8C组,494、E、E+494组的肌纤维排列更整齐,肌间隙减小,骨骼肌横截面积增加（p＜0.01,p＜0.001,p＜0.05）,表明运动和antagomir-494改善了衰老骨骼肌的形态特征,而抑制miR-494后并不影响抗阻运动的作用。透射电镜也显示,与P8C组相比,8周的干预使骨骼肌纤维的排列更整齐有序,且线粒体肿胀和空泡化现象得到了明显改善,并观察到了双层膜的自噬体。这些组织结构的变化表明,运动和antagomir-494能够有效改善骨骼肌的纤维排列和结构的异常、促进线粒体结构正常化,并促进自噬体的形成,从而增加骨骼肌纤维的横截面积。4.TUNEL染色:与R1组相比,P8C组凋亡的阳性细胞数目明显增多,细胞凋亡率显著上升（p＜0.01）。与P8C组相比,antagomir-494、抗阻运动、运动联合antagomir-494均能下调骨骼肌细胞凋亡率,其中运动组的凋亡阳性细胞率下降最为明显;表明衰老会加剧骨骼肌细胞的凋亡,而运动和/或antagomir-494能逆转这一现象。5.WB结果:1)能量代谢:与R1组相比,P8C组的蛋白Sirt1和p-AMPK/AMPK的比值均下降;经8周干预后,Sirt1和p-AMPK/AMPK的蛋白表达明显比P8C组高。运动联合antagomir-494对Sirt1的表达也具有明显的上调作用,但却导致了p-AMPK/AMPK的比值显著下调;表明antagomir-494和抗阻运动的单独干预能有效的提高衰老小鼠腓肠肌的能量代谢水平,二者结合干预对通过Sirt1-AMPK轴发挥的能量代谢作用仍需进一步探讨。2)蛋白质合成:与R1组相比,AKT、mTOR的磷酸化表达水平均明显下降;相反,与P8C组相比,8周的干预均能明显上调p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR的比值;表明antagomir-494和/或抗阻运动对SAMP8小鼠腓肠肌的蛋白质合成具有促进作用。3)自噬:经8周的自然饲养,P8C组小鼠腓肠肌自噬相关蛋白Beclin1的表达显著低于R1组（p＜0.001）,且p62和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的蛋白表达显著高于R1组,说明衰老骨骼肌自噬流受到抑制,导致p62和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ无法被及时清除。经运动干预后,与P8C组相比,抗阻运动组和联合干预组均能显著提高SAMP8小鼠腓肠肌Beclin1的蛋白水平,并显著降低p62的蛋白水平（p＜0.001）,说明抗阻运动能够有效激活自噬流;然而antagomir-494对Beclin1的激活作用并不明显,且产生了LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的上升,考虑可能是由于抑制剂造成的影响。对于线粒体自噬,运动能显著上调PINK1的表达,对Parkin具有上升的趋势;antagomir-494则能显著上调二者的表达,且运动联合antagomir-494对PINK1和Parkin的表达具有明显的叠加效果。这些结果表明,运动能够有效激活自噬,而antagomir-494似乎对线粒体自噬的活化更为明显。4)凋亡:与R1组相比,P8C组小鼠的BAX蛋白表达显著上调,而Bcl-2的蛋白表达显著下降。与P8C组相比,8周的干预后,antagomir-494组的BAX蛋白表达显著下降,Bcl-2表达显著上升;在运动组中,BAX的蛋白表达也显著下降,Bcl-2的表达无显著性变化,但Bcl-2/BAX的比值明显上升;表明抗阻运动和antagomir-494均对抑制衰老小鼠骨骼肌细胞的凋亡具有一定作用。结论:8月龄SAMP8快速衰老小鼠已表现出衰老性肌萎缩的现象,8周的抗阻运动能通过激活自噬、抑制凋亡、促进蛋白质合成、提高能量代谢水平延缓衰老性肌萎缩,antagomir-494在调控骨骼肌细胞凋亡、能量代谢和蛋白质合成方面也具有与抗阻运动类似的效果。然而,抗阻运动虽能够降低miR-494的表达,但是并非通过直接抑制miR-494的表达发挥其作用,由于运动带来的多重生理效应,可能通过不同的调控机制共同延缓衰老性肌萎缩。