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本研究主要围绕Hsf4tmlXyk基因敲除小鼠晶状体和视网膜的异常发育情况展开,旨在阐明HSF4在晶状体和视网膜发育中的作用及其异常所导致的病理变化的分子机制。
1.Hisf4mlXyk基因敲除小鼠晶状体的发育。
Hsf4突变影响小鼠晶状体的发育并导致晶状体混浊而发生白内障。利用蛋白质组学研究方法,发现在晶状体纤维细胞脱核过程中起到重要作用的vimentin的表达在Hsf4tmixyk基因敲除小鼠晶状体中明显上调。同时,晶状体的主要结构蛋白αB-晶状体蛋白的表达在Hsf4tmiXyk基因敲除小鼠晶状体中则显著下调。研究还证明:HSF4b是直接调控vimentin和αB-晶状体蛋白基因的表达。进一步的组织学研究确认,Hsf4miXyk基因敲除小鼠晶状体纤维细胞的正常脱核过程受到了影响。因此,HSF4的缺失导致了vimentin表达上调以及αB-晶状体蛋白表达下调,进而影响了晶状体纤维细胞的脱核过程,导致晶状体发育障碍和白内障形成。整个实验表明,在晶状体发育与白内障的发生过程中,vimentin和αB-晶状体蛋白是HSF4b的重要靶基因。基于这些研究结果,提出了以下假设:在正常情况下,HSF4b对vimentin起转录抑制作用,调控着vimentin在低水平表达。因此,在正常发育的晶状体中,晶状体纤维细胞能够不断脱核而形成成熟的晶状体纤维;另一方面,HSF4b对aB-晶状体蛋白起转录激活作用,调控着αB-晶状体蛋白在高水平表达,使晶状体能够正常发育。脱核的、正常发育成熟的晶状体纤维是维持晶状体透明的基础。在Hsf4miXyk基因敲除小鼠和HSF4突变的白内障患者,HSF4b的调控作用明显降低或缺失,导致vimentin表达上调,过量的vimentin表达直接阻碍了晶状体纤维细胞的脱核过程;另一方面,αB-晶状体蛋白的表达下调,低水平的αB-晶状体蛋白表达导致了晶状体发育的异常;这两种晶状体发育过程中的异常变化使晶状体混浊,形成白内障。这些实验结果也提示:HSF4b、vimentin和αB-晶状体蛋白可以作为白内障的干预治疗靶点,为今后研发治疗白内障的药物和基因治疗等非手术治疗提供了理论依据。
2.Hsf4tmlXyk基因敲除小鼠视网膜的发育。
Hsf4的缺失也影响小鼠视网膜的发育。组织形态学研究发现,Hsf4tmlXyk基因敲除小鼠视网膜外核层显著变薄,并可伴有局部脱离现象。进一步研究表明Pax6基因在Hsf4tmlXyk基因敲除小鼠视网膜中表达上调,主要发生在节细胞层和外核层。由于Pax6基因对RPE细胞发育起着重要的调节作用,以及视网膜局部脱离通常与RPE细胞异常有关,首先检测了代表RPE细胞发育和功能的一些主要标记物,包括Mitf,Occludin,Zol,Best1,Rpe65,Lrat,Cralbp和Pdef结果显示,这些基因在Hsf4tmlXyk基因敲除小鼠RPE细胞的表达明显下调。另一方面,基于视网膜外核层变薄及对光感受器细胞发育有重要调节作用的Pax6基因异常上调,用TUNEL法检测了视网膜的细胞凋亡情况,并在出生后4周的Hsf4tmlXyk基因敲除小鼠视网膜外核层检测到较多的凋亡信号。此外,发现Hsf4tmlXyk基因敲除小鼠视网膜中JNK的磷酸化水平和Caspase-3的活化形式显著上调,说明Hsf4tmlXyk基因敲除小鼠视网膜中细胞的凋亡可能是通过激活JNK通路而引起。而视网膜中ERK和αB-晶状体蛋白磷酸化水平的明显上调则提示其发挥着细胞保护功能。基于上述研究结果,假设:在Hsf4tmlXyk基因敲除小鼠视网膜中,Pax6基因的表达异常导致了MAPK通路在信号转导过程中的平衡失调,进而引起视网膜细胞的凋亡。这些研究结果为今后研究Hsf4tmlXyk基因敲除小鼠的视网膜发育和研发干预治疗方法提供了理论基础。进一步揭示晶状体与视网膜是密不可分的两部分,HSF4的突变对眼睛作为一个整体有着重要的影响,晶状体异常的动物模型中往往也伴随视网膜的发育异常。为今后研究白内障以及视网膜异常的动物模型开拓了思路。