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土壤重金属污染不仅会对自然生态环境造成破坏，更为严重的是通过食物链危害人类的生命和健康，成为人类食品安全的一大隐患。本文以重金属超富集植物印度芥菜(BrassicajunceaL.)的重金属转运蛋白基因BjHMA4和截形苜蓿(Medicagotruncatula)H+-PPase基因MtVP1为研究对象，对基因的功能进行了初步研究。
1、印度芥菜重金属转运蛋白基因BjHMA4的克隆及在转基因水稻和小麦中的功能研究
(1)BjHMA4的克隆及序列分析
近年来通过对拟南芥(Arabidopsisthaliana)和鼠耳芥（Arabidopsishalleri）P(1)B-ATPase基因家族成员(HMA4)的研究结果表明:植物体内Zn2+从根部向地上部分的转运必需有HMA4基因的参与，并且有实验结果表明HMA4也能转运Cd2+。以上发现说明，HMA4基因参与Zn和Cd在植物体内的转运。本实验克隆了印度芥菜HMA4基因的全长eDNA（命名为BjHMA4）。BjHMA4包含1个3816bp的最大读码框，编码1271个氨基酸。BjHMA4编码的氨基酸序列与来自拟南芥、遏蓝菜的HMA4序列的相似性分别为61％和64％，序列相似性较低主要是由于C-区域变化较大造成的。疏水性分析和结构预测表明BjHMA4蛋白是一个典型的膜蛋白，含有6个跨膜区，以及5个在HMA4中高度保守的区域(Metal-bindingdomain、A-domain、P-domain、N-domain和Histidine-richregion)和17个半胱氨酸对。从结构分析结果推测BjHMA4与AtHMA4在功能上具有相似性。表达模式研究的结果表明:在正常培养条件下，BjHMA4在根、茎、叶中的表达量没有明显差异;缺Mn和缺Cu培养条件下，BjHMA4的表达量没有明显影响，缺Zn条件下，BjHMA4在叶中的表达量上调，说明BjHMA4参与植物体内Zn稳态的调控，Zn2+有可能是其底物之一;在高浓度Cd和Zn处理下，BjHMA4在根部和地上部分中的表达量都明显上调，说明该基因可能参与Cd和Zn的吸收和转运，Cd2+和Zn2+是其潜在底物。Southernblotting结果表明BjHMA4以低拷贝的形式存在于印度芥菜基因组中。
(2)BjHMA4基因在大肠杆菌、酵母及水稻和小麦中的功能研究
原核表达抗性实验表明，BjHMA4的C端是热稳定的蛋白且BjHMA4的C端在大肠杆菌中异源表达提高了该菌的Zn耐受性。酵母转化实验表明，转入质粒pYES2-BjHMA4的菌株YK44在含CdCl2(40μM)或ZnCl2(200μM)的培养基中生长的要比只转入空载体pYES2的菌株YK44长得好，说明转入pYES2-BjHMA4的酵母菌株YK44有Cd/Zn抗性，由此推测Cd2+和Zn2+可能为BjHMA4的底物。在Cd和Zn胁迫下，BjHMA4的过量表达可互补酵母缺失的重金属离子转运功能，提高其对重金属的抗性。亚细胞定位结果显示该BjHMA4蛋白定位在质膜上。根据以上结果，我们推测BjHMA4可能是Cd/Zn外流型的转运蛋白。
目前，关于BjHMA4基因在单子叶植物中的功能至今未见报道。我们构建了单子叶植物表达载体pUN1301-BjHMA4和pLI-BjHMA4。采用农杆菌侵染水稻或小麦胚的方法，在抗生素培养基上最终获得转基因幼苗。通过PCR分析获得的阳性植株，进一步通过Realtime-PCR验证了转基因水稻或小麦中外源基因(BjHMA4)在转录水平的表达。
转基因水稻或小麦用Cd/Zn胁迫后与对照相比，根中重金属Cd/Zn浓度降低，而地上部分的Cd/Zn浓度升高。地上部分:根(Shoot(:)Root)含量比值都比对照要高，说明BjHMA4基因增强了重金属Cd/Zn从根到茎的转运。同时在Cd/Zn胁迫的条件下，转基因水稻或小麦增强Cd/Zn积累的同时对Cu，Fe，Mn的积累有正向协同效应，但在Cd/Zn胁迫下，转基因水稻和小麦从根到地上部分转运Cu，Fe，Mn的能力却存在差异，具体机理还有待于进一步的研究。
转基因水稻和小麦出现败育现象。与野生型相比，转BjHMA4水稻种子增强了人体必需的元素Cu和Zn的含量。转基因小麦种子增强了人体必需的元素Cu和Fe的含量。而其他的元素没有明显的变化。
综上所述，转BjHMA4基因的水稻和小麦增强了对重金属Zn和Cd的积累和转运能力;水稻种子中增强了人体必需的营养元素Cu和Zn的含量而小麦增强了Cu和Fe的含量。
2、截形苜蓿MtVP1基因在拟南芥和马铃薯中的功能研究
前期工作从截形苜蓿中克隆了Ⅰ型H+-PPase基因，命名为MtVP1，并将其定位到洋葱表皮细胞的质膜上。进一步的实验中我们发现:与野生型相比，过量表达MtVP1的拟南芥表现出发达的根系，且在4℃冷胁迫下，转基因植株的地上部分变红更明显;过量表达MtVP1的转基因马铃薯与野生型相比，促进了营养器官的形成和生长，且转基因马铃薯的芽和茎的基部都变红，开花时间也推后半个月左右。通过测定发现，转基因拟南芥的幼苗和马铃薯的芽中的花青素积累增强。更有趣的是，转基因马铃薯的块茎和芽中的蔗糖含量也都有明显的提高，由于马铃薯芽中的蔗糖来自于块茎，而芽中的蔗糖含量提高，可能是因为蔗糖从块茎到芽中的转运力增强。也就是说过量表达MtVP1可能增强了蔗糖从块茎到芽中的转运力。这与Fuglsangs等人的假说模型:H+-PPase影响着韧皮部蔗糖的转运是相一致的。有研究证明，蔗糖影响着花青素的积累。我们推测:过表达MtVP1基因能提高蔗糖从源到库的转运，进而影响花青素的积累。