血管网络是循环系统的重要组成部分，血液通过血管网络把氧气和营养物质输送到全身，是脊椎动物生存所不可缺少的。那么血管网络是怎样发育而来的呢?经过前人的研究，现在认为血管发生有两种截然不同而又紧密相连的发生方式：血管形成(vasculogenesis)和血管新生(angiogerlesis)。血管形成是指内皮细胞相互连接，在原位形成血管，主要发生在胚胎发育的早期；血管新生是指内皮细胞从已经存在的血管以向外出芽、迁移的方式形成较小的血管。体内绝大部分的血管是以血管新生的方式形成的。血管新生还是病理性血管发生的主要方式，比如癌组织的血管发生：抑制血管新生能显著抑制肿瘤的生长和转移。因此人们很关注这个领域，投入了大量的人力、物力来研究，但是目前血管新生的机制还没有完全研究清楚，特别是在内皮细胞怎样向靶组织特异性生长方面。 斑马鱼产卵量大，早期胚胎透明，体外发育，生长迅速，是很好的发育生物学模型，已经构建出了血管被绿色荧光蛋白特异标记的转基因品系和神经元被绿色荧光蛋白特异标记的转基因品系，非常适合研究血管发生和神经轴突导向。因此，我们实验室计划以斑马鱼为模型，采用反向遗传学的策略，从克隆基因入手，研究血管内皮细胞向靶组织特异性生长的机制。经过阅读分析文献，我们认为脊椎动物max-1是一个较好的候选基因。 max-1基因最初在线虫里被发现，其功能是调控神经轴突导向，在物种间相当的保守，人的max-1能部分拯救线虫max-1突变体。脊椎动物的神经网络和血管网络在结构上有相似性，而且己知部分神经轴突导向信号分子同时也调控血管的生长方向，那么max-1会不会也有类似的功能呢?在脊椎动物里还没有研究过max-1的功能，所以很值得尝试一下。 把线虫max-1的氨基酸序列提交到斑马鱼基因组数据库做比对，在17号染色体上发现了一个同源基因，命名为斑马鱼max-1。斑马鱼max-1有至少28个外显子，其cDNA长，4．6kb，序列信息已提交Genbank(DQS01275)，编码区从5’到3’端依次有PH、MyTH4和FERM三个结构域。序列比较表明斑马鱼max-1跟人的相似度最高。 RNA原位杂交显示，斑马鱼胚胎最早在尾芽期(bud stage)表达max-1，持续表达到至少第5天(实验只观察到第5天)。在这段时间里，max-1表达在神经组织、起源自中胚层的组织和上皮组织里。 Morpholino反义核酸敲低(knockdown)技术在斑马鱼里很有效，我们设计了两条阻断肋max-1 mRNA前体剪接的M0(morpholino oligo)，M01对应第9个外显子和第9个内含子的结合部，M02对应第8个外显子和第8个内含子的结合部。RT—PCR结果显示，这两条M0共同注射到受精卵里(每枚胚胎各注射5.2 ng)能完全阻断max-1 mRNA的正常剪接，只产生非正常的截短的无功能mRNA。 斑马鱼胚胎经两种阻断max-1剪接的M01和M02共注射后，导致缺乏功能性的max-1转录产物，虽没有表现出明显的整体畸形，但其中约83.7％的胚胎表现为体节间血管图式形成异常。经过同样处理的胚胎没有表现出明显的运动神经元轴突引导异常。提高M01和M02的注射量(每枚胚胎各注射10.2 ng)之后，斑马鱼胚胎的体节间血管发育和运动神经元轴突引导均表现出异常。这表明在脊椎动物中，max-1可能仍在神经元的轴突引导中起作用。 本文的分析集中在max-1对体节间血管图式形成的影响，如我们在低剂量注射时所观察到的，这可能表现了max-1更为特异的功能。对照胚胎的体节问血管在腹侧被限制在相邻体节的边界之间；当穿过了背腹中线之后，它便离开体节边界直接向背侧延伸，并与背中线血管相连。然而在M01和M02注射过的胚胎中，体节间血管经常被截短或异常分支，而不足在体节问遵循一个特定的图式。因此很可能某些体节间血管所需的引导信号被打乱了。 此前一些同时在轴突引导和血.管新生中起作用的信号分子已在斑马鱼中被报道，包括net in，senlaphorin，roho、neuropilin 和ephrin。为了检测它们中的基因会不会与max-1相互作用，我们选择了一些与max-1在相同发育阶段表达在体节里的基因作为可能拯救max-1敲低表型的候选基因。在这些候选基因是．Sema3Ab，ephrinb1，ephrinb2a，ephrinb2b，和ephrinb3,其中ephrinb3表现出部分拯救max-1反义核酸注射所导致的体节问血管缺陷表型的能力。RNA原位杂交结果确认了ephrinb3和max-1在从10体节期到26hpf的发育时期内在斑马鱼胚胎腹侧体节的表达有重叠。这些实验表明ephrinb3位于max-1的下游，即max-1通过作用于ephrinb3调控体节间血管的图式形成。上述假设与前人报道的Eph受体和ephrin能引发内皮细胞的黏着反应的事实相一致。生化研究表明Eph受体和ephrin在细胞膜上多聚化的程度调节着细胞水平的反应。MAX-1的FERM结构域介导了它在细胞膜下的定位，其PH结构域经常参与蛋白质向细胞膜的导向。我们的实验表明，ephrinb3与绿色荧光蛋白的融合蛋白通常定位在细胞膜上；然而通过M01和M02共注射抑制max-1基因的功能后，导致绿色荧光信号在细胞质中的过度聚集。这个发现表明，在斑马鱼中ephrinb3蛋白在细胞膜上的适当分布可能需要MAX-1功能的开三常存在。 综上所述，研究结果表明MAX-1为与内皮细胞迁移和血管图式形成相关的引导通路中的关键因子；这进一步加强了人们对于血管新生与神经发育在调控机制上具有相似性的认识。 此外，在研究生学习期间，还对斑马鱼脑脂肪酸结合蛋白(bfabvp)在早期胚胎发育过程中的表达图案和重组激活基因(rag)在种系细胞免疫球蛋白基因重排过程中的作用进行了研究。