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新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)所致疫病鸡新城疫(ND)又称亚洲鸡瘟,是禽类的一种以呼吸道、消化道黏膜出血为典型症状的高度接触性急性败血性传染病,国际兽疫局把ND定为A类传染病,严重危害畜牧业和人类健康。近年来,我国多次出现此疫情,给我国养殖业构成极大的威胁,并导致严重的经济损失。因此,寻找一种理想的免疫保护性抗原用于该病的快速诊断与免疫防治以及加强NDV分子流行病学的研究具有重要实际意义。融合蛋白(Fusion Protein,F)是新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)穿入细胞膜,发挥致病作用重要的糖蛋白,与病毒的致病性和毒力密切相关。F蛋白先是以惰性F0的形式合成,当它转运到高尔基体表面时,被宿主细胞蛋白酶裂解成F1和F2两个亚单位,使病毒具有感染活性。裂解后的活性蛋白一旦到达细胞膜表面即可介导感染细胞与邻近细胞的融合,并逐步扩大感染范围。本课题拟对NDV F48E9株F蛋白为研究对象,在对其克隆测序后,构建pGEX-4T-1-F重组质粒并进行原核表达。旨在从分子水平探讨NDV F48E9株F蛋白结构特征,表达获得大量F蛋白,为下一步制备NDV单克隆抗体、研究其功能提供物质基础,也为进一步研制NDV基因工程疫苗奠定基础。首先,根据GenBank已知NDV F48E9株F基因序列和原核表达质粒PGEX-4T-1的多克隆位点设计一对引物,以含鸡新城疫病毒(NDV)强毒F48E9株F基因重组质粒pcDNA-F为模板,PCR扩增获得594bp长度的片段,经单酶切鉴定,与GenBank中登录的NDV F48E9株F基因序列含有相同的单酶切位点。其次,PCR产物分离纯化后连接到原核表达载体pGEX-4T-1的多克隆酶切位点,经质粒PCR和EcoRⅠ、SalⅠ双酶切鉴定,筛选出阳性重组克隆,构建成F基因片断的原核表达质粒,并命名为pGEX-4T-1-F。将此原核表达重组质粒pGEX-4T-1-F转化大肠杆菌BL21,经37℃和1.0mmol/L IPTG的诱导,SDS-PAGE凝胶电泳表明所克隆的基因片段在大肠杆菌中得到融合表达,表达出谷胱甘肽-S-转移酶(GST)与F的融合蛋白GST-F,且表达产物主要以包涵体的形式存在。所获得的融合蛋白分子量分别约为46 KD,与预期结果相符。最后,通过优化原核表达条件,确定了原核表达重组质粒pGEX-4T-1-F的最佳诱导时间和诱导剂浓度,我们用优化的原核表达条件对含有pGEX-4T-1-F质粒的BL21菌进行了大量诱导表达,实验中使用反复冻融和超声方法来裂解诱导表达菌,获得了较高浓度的GST-F包涵体蛋白,用十二烷基肌氨酸钠加超声波的方法使包涵体充分溶解,提取了大量的可溶性GST-F原核融合表达蛋白。Western-Blot免疫印迹分析表明,此融合蛋白能与NDV阳性血清发生特异性反应,具有良好的抗原性。综上所述,本研究成功地克隆了鸡NDV F48E9株F基因,并进行了原核表达,获得了大量的GST-F原核融合表达蛋白,这些都为进一步研究鸡NDV-F分子免疫学功能及其应用提供了试验材料。这些都为进一步制备NDV单克隆抗体、研究其生物学功能提供了物质基础,也为进一步研制NDV基因工程疫苗奠定基础。MHCⅡ类分子是呈现在免疫系统特定细胞表面的由α链和β链非共价键相连组成的一组高度多态性的跨膜糖蛋白。这些分子提呈经过加工的外来抗原给辅助性T细胞的抗原受体(TCR),导致辅助性T细胞激活和分化,从而在诱发免疫应答中起重要的作用。MHCⅡ类分子不正常表达会引起严重的免疫缺陷疾病。Ii链是一种非多态性的Ⅱ型跨膜蛋白,作为分子伴侣,在调节MHCⅡ类分子的表达和功能方面发挥重要作用。首先,根据GenBank中登录的鸡类MHCⅡ的α链和β链基因及Ii序列与载体pEGFP-C1及pDsRed2-N1的多克隆酶切位点分别设计三对引物,应用PCR技术从重组质粒pGEX-4T-1/α、pGEX-4T-1/β、pcDNA3-Ii中扩增出编码鸡α链(771bp)和β链(798bp)以及Ii(672bp)基因片段。将α、β、Ii片段分别连入绿色荧光蛋白载体上,Ii片段连入红色荧光蛋白载体上,构建真核表达质粒GFP-α、GFP-β、GFP-Ii和RFP-Ii。经PCR和双酶切鉴定,结果表明,所有目的片段均成功插入相应的载体上。其次,由于鸡MHCⅡ分子及Ii链与哺乳动物的同源物之间不仅在氨基酸水平上具有很高的同源性,而且在分子结构上很相似,因此它们应该与其哺乳动物的同源物一样在外源性抗原提呈中发挥重要作用。但是目前还没有关于鸡MHCⅡ分子与Ii链之间的相互作用的报道,在本实验中,我们将GFP-α、GFP-β融合基因与Ii基因共同转染293细胞,荧光显微镜观察结果表明,它们之间存在共定位。最后,我们通过将GFP-α、GFP-β和GFP-Ii同时共转染293细胞,或者将GFP-α、GFP-β和GFP-Ii 36h分别转染293细胞,36h后裂解细胞获得蛋白,再利用免疫印迹法对三者之间的关系进行探讨。结果表明,GFP-α、GFP-β和GFP-Ii三者共同转染时分子量均有变化,但是其原因还不清楚。综上所述,本研究通过对鸡MHCⅡ的α链和β链基因及恒定链Ii基因的真核构建,利用荧光显微镜观察,观察MHCⅡ的α链和β链基因及Ii基因在293细胞上的定位,推断恒定链Ii与MHCⅡ的α链和β链在细胞中可能存在相互作用,为下一步探讨MHCⅡ与Ii之间的关系以及恒定链参与的DNA疫苗研究奠定基础。