铁是维持细胞功能的重要辅助因子,也是维持神经元功能的必需元素,广泛参与体内代谢过程。然而,研究发现,黑质区铁聚积参与帕金森病（Parkinson’s disease,PD）的发病过程。但目前铁选择性沉积于黑质区的具体原因尚未明确。脑内过量的铁可以通过Fenton反应与H₂O₂生成大量的OH·,加重细胞氧化应激反应。越来越多的证据表明,脑内铁聚积与神经退行性疾病有关。有证据表明,L型Ca²⁺通道（L-type calcium channels,LTCCs）可能介导Fe²⁺进入多巴胺（dopamine,DA）能神经元参与PD发病过程,使用LTCCs阻断剂能延缓PD的发病;然而,LTCCs参与PD发病的具体机制仍不明确。中脑DA能神经元存在自主起搏现象,其自主起搏依赖L型Cav1.3型钙通道。研究还发现,高铁状态下,LTCCs是铁进入心肌细胞的主要途径。为探讨在PD发病过程中,DA能神经元上LTCCs是否直接介导Fe²⁺进入细胞,以及Ca²⁺对Fe²⁺造成的DA能神经元毒性的影响及可能机制,本实验以DA能MES23.5细胞和原代培养的腹侧中脑（ventral mesencephalon,VM）神经元为观察对象,选用小剂量的MPP⁺（5μmol/L）预处理细胞24 h,在不同浓度的Fe²⁺和/或Ca²⁺作用下,应用免疫荧光技术观察细胞核形态的变化,流式细胞术检测细胞内活性氧类物质（reactive oxygen species,ROS）水平和线粒体膜电位（mitochondrial transmembrane potential,ΔΨm）的改变,免疫印迹法检测凋亡蛋白caspase-3的表达水平,激光共聚焦显微镜技术检测VM神经元摄铁功能的变化以及Fe²⁺对VM神经元内Ca²⁺浓度的影响,同时观察LTCCs阻断剂伊拉地平对上述作用的影响。研究结果如下:1.应用Hoechst染色,我们检测了MES23.5细胞的细胞核形态的变化。与MPP⁺组相比,MPP⁺/Fe²⁺共处理组的细胞核损伤显著,出现明显的核固缩、碎裂和染色质边集等凋亡的形态学变化（P<0.001）;而应用钙通道阻断剂伊拉地平对Fe²⁺造成的细胞核损伤有明显的保护作用（P<0.01）。MPP⁺/Ca²⁺/Fe²⁺共处理组细胞的核损伤远大于MPP⁺/Fe²⁺共处理组（P<0.01）;而应用钙通道阻断剂伊拉地平对Ca²⁺和Fe²⁺共同造成的细胞核损伤有明显的保护作用（P<0.01）。2.应用MAP2和Hoechst双染,我们检测VM神经元细胞核形态的变化。与MPP⁺组相比,MPP⁺/Fe²⁺共处理组的细胞核损伤数目增加（P<0.001）,出现明显的核固缩、碎裂等;而应用伊拉地平对Fe²⁺造成的VM神经元损伤有明显保护作用（P<0.05）。MPP⁺/Ca²⁺/Fe²⁺共处理组的损伤远大于MPP⁺/Fe²⁺共处理组（P<0.05）;而应用伊拉地平对Ca²⁺和Fe²⁺共同造成的VM神经元的核损伤有明显的保护作用（P<0.05）。3.应用流式细胞术,我们检测了MES23.5细胞的ΔΨm变化。与MPP⁺组相比,Fe²⁺共孵育可以使ΔΨm降低25%（P<0.001）;而应用伊拉地平能明显改善Fe²⁺造成ΔΨm降低的情况（P<0.01）。MPP⁺/Ca²⁺/Fe²⁺处理组的ΔΨm比MPP⁺/Fe²⁺处理组降低12%（P<0.05）;而应用伊拉地平能明显改善Ca²⁺和Fe²⁺造成ΔΨm降低的情况（P<0.001）。4.应用流式细胞术,我们同时检测了VM神经元ΔΨm的变化。与MPP⁺组相比,MPP⁺处理后加Fe²⁺孵育可以使ΔΨm降低26%（P<0.001）;而应用伊拉地平可改善Fe²⁺造成VM神经元ΔΨm降低的情况（P<0.01）。MPP⁺/Ca²⁺/Fe²⁺共处理组的细胞ΔΨm,比MPP⁺/Fe²⁺共处理组降低11%（P<0.01）;而应用伊拉地平能明显改善Ca²⁺和Fe²⁺造成VM神经元ΔΨm降低的情况（P<0.001）。5.运用荧光染料H₂DCF-DA,我们检测了细胞内ROS的水平。MPP⁺/Fe²⁺共处理组的细胞ROS水平约为MPP⁺处理组的1.8倍（P<0.001）;而应用伊拉地平可部分阻止Fe²⁺造成的ROS的升高（P<0.05）。MPP⁺/Ca²⁺/Fe²⁺共处理组的细胞ROS水平约为MPP⁺/Fe²⁺处理组的1.28倍（P<0.05）;而应用伊拉地平可部分阻止Ca²⁺和Fe²⁺造成的VM神经元内ROS水平的升高（P<0.001）。6.应用western blot,我们检测了MES23.5细胞内激活型caspase-3蛋白水平的变化。MPP⁺/Fe²⁺组的激活型caspase-3蛋白的表达量是MPP⁺组的2.3倍（P<0.001）;而伊拉地平可部分阻断Fe²⁺造成的MES23.5细胞内激活型caspase-3蛋白表达量的增加（P<0.05）。MPP⁺/Ca²⁺/Fe²⁺共处理组激活型caspase-3的表达量是MPP⁺/Fe²⁺共处理组的1.3倍（P<0.05）;而应用伊拉地平能明显阻断Ca²⁺和Fe²⁺造成MES23.5细胞内caspase-3蛋白的激活（P<0.001）。7.我们同时检测了VM神经元的激活型caspase-3蛋白水平的变化。MPP⁺/Fe²⁺共处理组的激活型caspase-3蛋白水平的表达量是MPP⁺组的3.02倍（P<0.001）;而应用伊拉地平可部分阻断Fe²⁺对VM神经元造成的损伤（P<0.05）。MPP⁺/Ca²⁺/Fe²⁺组的激活型caspase-3的表达量是MPP⁺/Fe²⁺组的1.59倍（P<0.01）;而应用伊拉地平能明显阻断Ca²⁺和Fe²⁺造成VM神经元内caspase-3蛋白的激活（P<0.001）。8.5μmol/L MPP⁺处理体外培养的VM神经元24 h后,应用荧光染料calcein作为指示剂,利用激光共聚焦显微镜检测VM神经元的摄铁能力,其荧光越强,摄铁能力越弱。结果显示,使用100μmol/L FeSO₄灌流,与对照组相比,VM神经元的荧光强度降低,表明其摄铁能力增加;当灌流液中加入10μmol/L伊拉地平后,与MPP⁺组相比,VM神经元的荧光强度增加,表明其摄铁能力减弱;当灌流液中加入10μmol/L的Bayk8644后,与MPP⁺处理组相比,VM神经元的摄铁能力明显增强。9.利用激光共聚焦显微镜,我们进一步检验了Fe²⁺对VM神经元细胞内游离Ca²⁺浓度是否有影响。与对照组相比,MPP⁺、MPP⁺/Ca²⁺（2.5 mmol/L）共处理组的胞内Ca²⁺水平随着时间的推移,并没有发生大幅度的变化。与MPP⁺组相对比,MPP⁺/Fe²⁺处理组会促进胞内Ca²⁺的小幅度升高。与MPP⁺/Fe²⁺组相比,增大细胞外Ca²⁺的浓度（增大至2.5 mmol/L）,胞内Ca²⁺浓度大幅升高;同时加入钙通道阻断剂伊拉地平能阻断胞内Ca²⁺浓度的升高。综上所述,阻断或激活LTCCs,可改变神经元铁的转运过程,即LTCCs可以介导铁的转运。细胞内增加的铁可以导致细胞ΔΨm降低,ROS水平升高,最终激活caspase-3途径引起细胞的凋亡。并且,MPP⁺/Ca²⁺/Fe²⁺共处理组比MPP⁺/Fe²⁺处理组对细胞的损伤显著增强,而MPP⁺/Ca²⁺组未对细胞造成明显损伤,提示细胞外高Ca²⁺可显著加重Fe²⁺的毒性作用。这可能是因为进入到细胞内的Fe²⁺造成钙通道的持续开放,Ca²⁺内流增加造成钙超载,也可能是由于游离Ca²⁺升高加剧了Fe²⁺的毒性造成的。应用钙通道阻断剂伊拉地平对Fe²⁺造成的细胞损伤有明显的保护作用。本研究为探索PD发病过程中LTCCs的作用及LTCCs介导铁聚积的机制提供了新的实验依据。