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长白山白眉蝮蛇(Agkistrodon blomhoffii ussurensis)属于蝰蛇科蝮蛇亚科白眉蝮乌苏里亚种,俗名日本蝮蛇(Manushi),主要分布于我国东北部、朝鲜及俄罗斯的部分地区。磷脂酶A2(phospholipase A2,PLA2)能够在磷脂甘油部分的磷脂酰基(sn-2)位点选择性断裂酯键,生成的产物为溶血磷脂和脂肪酸。在蛇毒中存在许多PLA2同工酶,它们之间的氨基酸序列的同源性大于90%,结构也较为相似,但却具有不同的药理生理功能。本论文建立了简单有效分离PLA2的方法。长白山白眉蝮蛇蛇毒经过DEAESephadexA-25柱初步分离,得到了11个蛋白峰。经鉴定,峰-5、峰-7有磷脂膜A2活性。对其二者进行Sephadex G-75脱盐以及进一步分离纯化,收集峰5-2-2,峰7-3,冷冻干燥。冷冻干燥后对该两个组分经SDS-PAGE电泳实验,发现峰7-3显示单一条带,峰5-2-2显示3条带。采用Agilent ZORBAX 300SB-C18反相柱(4.9×250 mm)对峰7-3进行HPLC检测,检测结果显示单一峰,杂峰比例很低(<3%)。得到PLA2酶纯品为70mg,蛋白浓度为0.8mg/ml。酶活测定显示,该PLA2酶活(37℃)为41μmol/mg min;而酶活追踪显示粗毒PLA2酶活为17μmol/mg min,酶活回收超过100%,出现该现象的原因可能是:蛇毒是多种蛋白组分的混合物,各种不同的组分存在着相互竞争的关系,从而导致其中某些组分对PLA2的活性发挥起了抑制作用,使得PLA2的活力回收超过100%。该PLA2的最适温度在50℃左右,最适pH在pH8.5左右。将该PLA2在100℃下保温1h,酶活仅丧失60%多一点,并未完全失活,可以说该PLA2有一定的热稳定性,这与该酶的6-7对的二硫键有关;PLA2在酸性环境下可以较为稳定的存在,基本不丧失活力。但是在pH>9的情况下,活力迅速丧失。对该PLA2进行体外抗肿瘤活性研究,结果发现其对Hela、K562细胞均无明显抑制效果。根据“靶位点与作用位点”学说,PLA2欲产生药理毒理活性,首先必须在其表面存在能够与靶细胞结合的结合位点,进而与靶细胞的靶位点结合,才能水解细胞,发挥其药理毒理活性。我们分离得到的PLA2无法对肿瘤细胞产生抑制作用,很有可能是PLA2表面不存在与靶细胞结合的作用位点,因此导致其不能与细胞结合,从而无法发生抑制作用。同时,本实验又对心脏毒素(Cardiotoxin,CTX)与类心脏毒素(Cardiotoxin-like basic protein,CLBP)的协同作用效应进行了研究。依次采用CM Sephadex C-25、Sephadex G-75、HPLC等层析方法从眼镜蛇粗毒中分离得到了CTX,CLBPⅪ。对二者进行协同作用效应研究发现,在CTX低浓度下,CTX与CLBP二者之间确实存在着某种协同作用效应,当二者同时存在时,毒性大大增强。然而,当CTX高浓度时,协同作用消失。一些蛇毒的心脏毒素在晶体结构时能够形成稳定的二聚物或多聚物实体,当心脏毒素的浓度太低而不能破坏正常细胞时,CLBP可以通过其结构的基本特征一三指结构来“模拟”致死毒素,这样,从某种意义上来说,就提高了致死毒素的浓度,从而导致细胞的死亡。然而,一旦致死毒素达到一定浓度时,由于竞争效应,CLBP亲和力较低,无法与底物有效结合,从而导致协同作用效应消失。