研究背景和目的心力衰竭(Heart Failure,HF)是指由于各种病因所引起的心室收缩(舒张)功能下降、射血功能障碍,从而使心排血量不能满足机体代谢的需要,器官、组织血液灌注不足引起的一些列临床综合征。在发达国家中,有近1-2%的成年人患有心力衰竭,在70岁以上的人群中,其发病率可以高达10%。而心力衰竭晚期的5年死亡率高达50%,其恶性程度不低于癌症和艾滋病。心肌肥厚是心脏为适应各种刺激而产生的心肌细胞体积增大,重量增加,是心力衰竭过程中早期代偿关键阶段。目前研究认为,引起心肌肥厚的主要机制有,机械性与神经内分泌系统激活,慢性炎症反应激活等。了解心力衰竭的机制,特别是心肌肥厚向心力衰竭转变的过程,对于人们认识心力衰竭以及在临床中提供新的治疗策略有着重要的意义。心力衰竭发生发展的过程是一个伴随慢性炎症反应发生发展的病理过程。炎症细胞因子常在心力衰竭病人体内高表达,其通过影响心肌收缩力,引起心肌肥大,诱导心肌纤维化和凋亡,促进心脏重构等作用促进心力衰竭的发生发展。其中,瘤坏死因子(Tumor necrosis factor alpha,TNF-α)就是众多炎症因子的关键因子之一。自从1990年Levine等人发现炎症因子TNF-a在心力衰竭患者体内表达量明显升高之后,研究人员围绕TNF-a对心力衰竭的影响进行了大量深入的研究,证实TNF-a及其受体在心肌肥厚和心力衰竭过程中扮演了重要的角色。其中目前公认的TNF-a对心肌主要影响包括：干扰细胞Ca2+内流,激活一氧化氮合酶(NOS),升高局部NO水平,抑制心肌收缩力；激活基质金属蛋白酶(MMPs)和抑制基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)的表达参与细胞外基质重塑；TNF-α与TNF-αR1或Fas结合后,激活细胞凋亡的信号转导通路诱导心肌细胞凋亡等。鉴于TNF-α对心肌众多负性调节作用,抗肿瘤坏死因子治疗方案也用于实验和临床研究。然而,通过10年的研究,虽然抗肿瘤坏死因子治疗在发生心力衰竭的大鼠和小鼠中被证明是有效的,但是在上世纪栋、本世纪初进行的TNF-a拮抗剂治疗心力衰竭病人的随机、双盲大规模临床试验中却没有出现明显的效果,甚至提高了心力衰竭患者的住院率和死亡率。所以对TNF-α进行更深入、更细致的研究对于了解炎症因子在心力衰竭中的作用机制以及解决抗炎治疗在临床中的问题具有重要意义。第一部分不同TNF-α受体对压力负荷诱导所致心肌肥厚小鼠的作用及其机制实验目的：探讨在不同TNF-α受体在压力负荷诱导所致心肌肥厚小鼠的作用及其机制实验方法：1.本实验通过使用胸主动脉缩窄手术方法诱导压力负荷性小鼠心力衰竭模型。以野生型小鼠为对照,在手术后2周观察该心力衰竭模型在不同TNF-α受体敲除小鼠(TNFR1敲除小鼠,TNFR2敲除小鼠,TNFR1/2双敲除小鼠)所出现的心肌肥厚进展情况。检测各个组中小鼠心脏形态、功能、血流动力学改变,炎症因子变化情况,并对心肌肥厚相关信号通路进行检测,以明确与不同TNF-α受体相关的关键信号通路。2.使用AngⅡ诱导H9c2(2-1)心肌细胞肥大,分别转染相关TNF-α受体siRNA检测其对心肌细胞肥大的作用机制及相关信号通路,证实体内试验并予以阻断关键通路以检测其能否达到改善心肌肥大的效果。实验结果：1.不同TNF-α受体在胸主动脉缩窄诱导的压力负荷性心肌肥厚中介导不同的效应,也就是NFR1可以加重心肌肥厚程度、加重心脏收缩舒张功能障碍,TNFR2可以减轻心肌肥厚程度、改善心脏收缩舒张功能。2.在胸主动脉缩窄诱导的压力负荷性心肌肥厚中两种TNF-α受体表达量均增加,但是TNFR1升高程度要高于TNFR2升高程度。3.两种TNF-α受体在胸主动脉缩窄诱导的压力负荷性心肌肥厚中介导不同的炎症反应,通过TNFR1促进促炎因子(TNF-α、IL-1β. IL-6等)减少抗炎因子(IL-10)表达,反之,TNFR2可以降低促炎因子表达,增强抗炎因子表达。4.不同TNF-α受体介导不同心肌肥大相关信号通路。5.用siRNA沉默TNFR1表达可以减轻血管紧张素诱导的心肌细胞肥大,用siRNA沉默TNFR2可以加重血管紧张素诱导心肌细胞肥大。6. TNFR1可以通过NFκB活化诱导心肌细胞肥大,而TNFR2可以通过激活AKT信号通路达到保护心肌细胞的作用。第二部分两型TNF-α与不同TNF-α受体对压力负荷诱导所致心肌肥厚小鼠的作用及其机制实验目的：探讨跨模型和分泌型TNF-α与不同TNF-α受体在压力负荷诱导所致心肌肥厚小鼠的作用及其机制实验方法：1.在胸主动脉缩窄手术方法诱导压力负荷性不同TNF-α受体敲除小鼠心力衰竭模型中使用Alzet微量注射泵,给予TNF-α转化酶(TNF-α-converting enzyme, TACE)抑制剂TAPI-1,以减少tmTNF-α向sTNF-α转变。观察tmTNF-α高表达时在不同’TNF-α受体敲除小鼠中对心肌肥厚的作用和影响,了解tmTNF-α与两种受体相互关系,并找出相关信号通路。2.在体外使用sTNF-α干预转染相关TNF-α受体siRNA的H9c2(2-1)心肌细胞模拟高水平sTNF-α与不同受体相互关系及其对心肌细胞的作用和影响；使用高表达tmTNF-a的NIH3T3细胞与转染相关TNF-a受体siRNA的H9c2(2-1)心肌细胞共培养,模拟高水平tmTNF-a与不同受体相互关系及其对心肌细胞的作用和影响。检测细胞增殖和凋亡相关通路,证实不同类型TNF-a和不同TNF-a受体相互关系,以及其对心肌细胞的作用和影响。实验结果：1.在胸主动脉缩窄诱导的心肌肥厚模型中,tmTNF-a和sTNF-a表达和分泌量均有增加。2.使用微量注射泵给予TACE抑制剂TAPI-1抑制tmTNF向sTNF转变可以缓解胸主动脉缩窄诱导小鼠心肌肥厚程度。这种效应在野生型、TNFR1和TNFR2敲除小鼠中均可以检测到,但是在TNFR2敲除小鼠中效应更明显。3.通过体外试验,我们证明了sTNF主要通过TNFR1介导心肌细胞胞毒效应和诱导心肌细胞凋亡,而tmTNF可以通过TNFR2成少心肌细胞凋亡和保护心肌的作用。第三部分初步探讨骨髓来源抑制性细胞(myeloid-drived suppressor cells, MDSC)对压力负荷诱导所致心肌肥厚小鼠的作用实验目的：探讨MDSC在心力衰竭患者及心肌肥厚小鼠中的作用及机制实验方法：1.通过流式细胞术检测心力衰竭患者外周血中MDSC比例,证实MDSC与心力衰竭之间的关系。在不同TNFR敲除小鼠建立胸主动脉缩窄术诱导心肌肥厚,并通过流式细胞术检测外周血、脾脏和心肌组织中MDSC变化情况。2.在体外将不同类型MDSC进行分离和纯化,将其与心肌细胞直接或间接共同培养,并检测其对血管紧张素诱导心肌细胞肥大影响和机制。实验结果：1.心力衰竭患者外周血中MDSC数量随着心力衰竭程度加重而升高。2.胸主动脉缩窄诱导心肌肥厚小鼠外周血、脾脏和心肌组织中MDSC比例均有增加,但TNFR1敲除小鼠MDSC增加比例最多。3.通过体外MDSC与心肌细胞直接或间接共培养证明,MDSC与心肌细胞直接接触时可以通过增加IL-10表达减轻血管紧张素诱导的心肌细胞肥大,且表达TNFR2的MDSC IL-10表达量更高,抗心肌肥厚功能更强。统计学分析计量资料数据均以均值士标准误表示,应用SPSS13.0软件进行统计学分析。两组均数比较选择t检验,对3组以上均数进行组间比较,用单因素方差分析(ANOVA),p<0.05则认为差异有统计学意义。结论1.在胸主动脉缩窄诱导的压力负荷性心肌肥厚中tmTNF、sTNF及其TNF-a受体表达量均增加,但是TNFR1升高程度要高于TNFR2升高程度。2.不同TNF-a受体在胸主动脉缩窄诱导的压力负荷性心肌肥厚中介导不同的效应：TNFR1可以加重心肌肥厚程度、加重心脏收缩舒张功能障碍,TNFR2可以减轻心肌肥厚程度、改善心脏收缩舒张功能。3.两种TNF-a受体在胸主动脉缩窄诱导的压力负荷性心肌肥厚中介导不同的炎症反应,通过TNFR1促进促炎因子(TNF-α、IL-1β、IL-6等)减少抗炎因子(IL-10)表达,反之,TNFR2可以降低促炎因子表达,增强抗炎因子表达。4.不同TNF-a受体介导不同心肌肥大相关信号通路。5.siRNA沉默TNFR1表达可以减轻血管紧张索诱导的心肌细胞肥大,用siRNA沉默TNFR2可以加重血管紧张素诱导心肌细胞肥大。6.TNFR1可以通过NFκB活化诱导心肌细胞肥大,而TNFR2可以通过激活AKT信号通路达到保护心肌细胞的作用。7.抑制tmTNF向sTNF转变可以缓解胸主动脉缩窄诱导小鼠心肌肥厚程度。尤其是在TNFR2敲除小鼠中效果更明显。8.sTNF主要通过TNFR1介导心肌细胞胞毒效应和诱导心肌细胞凋亡,而tmTNF可以通过TNFR2减少心肌细胞凋亡和保护心肌的作用。9.心力衰竭患者外周血中MDSC数量随着心力衰竭程度加重而升高。10.胸主动脉缩窄诱导心肌肥厚小鼠外周血、脾脏和心肌组织中MDSC比例均有增加,但TNFR1敲除小鼠MDSC增加比例最多。11. MDSC与心肌细胞直接接触时可以通过增加IL-10表达减轻血管紧张素诱导的心肌细胞肥大,且表达TNFR2的MDSC IL-10表达量更高,抗心肌肥厚功能更强。