C-jun基因沉默对鼻咽癌裸鼠成瘤及血管生成影响的实验研究

来源 :广西医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jshaczcl
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目的:研究慢病毒介导的c-jun基因沉默对人鼻咽癌放射抗拒系CNE-2R细胞裸鼠移植瘤生长及血管生成的影响,并探讨其可能的作用机制,为鼻咽癌基础研究及临床治疗提供新思路和实验依据。  方法:根据我们前期的实验方法,利用携带shRAN的慢病毒载体感染CNE-2R细胞以沉默c-jun基因,构建稳定c-jun基因沉默的CNE-2R细胞株c-jun-shRNA-CNE-2R细胞组(c-jun-shRNA组),病毒干扰阴性对照NC-shRNA-CNE-2R细胞组(NC组),以及未作任何处理CNE-2R细胞为空白对照组(Control组),qRT-PCR及Western blot实验检测c-jun基因沉默效果及三组细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白的表达水平。并应用三组细胞分别在15只裸鼠(雄性,4-6周龄,每组5只)右侧腹股沟构建裸鼠皮下移植瘤模型。连续6周观察三组细胞裸鼠皮下种植瘤生长情况,并使用游标卡尺每周定时测量移植瘤的长径(a)和短径(b),记录体积变化情况并绘制生长曲线,比较三组裸鼠移植瘤体积;选取第二、三、四、五、六周5个时间点行重复测量方差分析比较三组移植瘤分组效应、时间效应和分组×时间效应的统计量;6周末终止观察并处死所有裸鼠,剥离三组裸鼠移植瘤并称重进行统计分析;移植瘤分组包埋蜡块切片,免疫组化化学法检测移植瘤组织c-jun、VEGF、CD34的表达,并根据CD34表达情况检测组织内微血管密度(microvessel density,MVD)改变。分析c-jun基因沉默对鼻咽癌生长及血管生成的影响。采用SPSS17.0统计软件对数据进行分析。实验数据以均数±标准差((-x)±s)表示,两组间均数比较用t检验,多组间比较采用方差分析(ANOVA),肿瘤体积生长比较采用重复测量方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。  结果:(1)对人鼻咽癌放射抗拒性细胞CNE-2R慢病毒转染成功,qRT-PCR、western blot结果验证CNE-2R细胞中c-jun基因沉默效果好。(2)qRT-PCR、westem blot结果显示c-jun基因沉默致CNE-2R细胞VEGF表达下降。(3)鼻咽癌裸鼠皮下移植瘤模型成功建立,接种细胞1周后,所有实验裸鼠移植部位触及肿块,成瘤率达100%。(4)在6周的连续观察内,第一、二周内三组移植瘤生长体积明显差异无统计学意义。第三、第四、第五、第六周观察期c-jun-shRNA组裸鼠移植瘤体积较NC组和Control组增长缓慢,c-jun-shRNA组移植瘤体积明显小于NC组与Control组(均P<0.05),而NC组与Control组之间比较无统计学差异(P>0.05)。第6周末c-jun-shRNA组种植瘤体积为(720.85±72.10)mm3,NC组体积(1196.81±90.69)mm3,Control组(1203.76±100.42)mm3。重复测量方差分析显示,分组效应、时间效应和分组×时间效应的统计量分别为F分组=52.276、P分组=0.001,F时间=89.437、P时间=0.000,F分组×时间=25.187、P分组×时间=0.001,结果分组效应、时间效应和分组×时间效应均有统计学意义。分组效应说明c-jun-shRNA组裸鼠移植瘤明显小于Control及NC组,时间效应说明三组移植瘤的体积均随时间的延长而增长,分组×时间效应具有统计学差异说明分组和时间具有交叉作用;从移植瘤体积的增长速度中可以发现,c-jun-shRNA组随时间延长移植瘤体积增长的幅度比Control及NC组增长的幅度明显减少。(5)处死裸鼠剥离移植瘤并称重,三组质量分别为:c-jun-shRNA组为(0.423±0.040)g,NC组(0.798±0.081)g,Control组质量为(0.825±0.053)g,cjun-shRNA组移植瘤质量显著小于NC及Control组(均P<0.05);而NC组与Control组之间比较无统计学差异(P>0.05)。(6)免疫组化检测结果显示,c-jun-shRNA组移植瘤c-jun、VEGF、CD34蛋白较NC组及Control组表达蛋白明显下降P<0.05)。(7)根据移植瘤切片CD34表达对组织内微血管密度(MVD)分析,结果显示c-jun-shRNA组MVD为(11.69±3.30)分级为1-2级;NC组MVD为(32.56±7.33),Control组MVD为(35.45±4.87),分级均为3-4级,c-jun-shRNA组MVD计数及VEGF表达均明显低于NC组和Control组(均P<0.05)。  结论:(1)c-jun基因沉默可下调鼻咽癌放射抗拒细胞CNE-2R中VEGF的表达。  (2)c-jun基因沉默抑制鼻咽癌裸鼠移植瘤生长及微血管生成。  (3)c-jun基因沉默通过下调VEGF抑制鼻咽癌移植瘤生长及微血管生成。
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