【摘 要】
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目的:通过建立SD大鼠心肌梗死模型及H9c2心肌细胞缺氧损伤模型,研究大黄酸预处理对心肌细胞线粒体自噬及线粒体分裂的作用,探究大黄酸对缺氧心肌细胞的保护作用及其机制。方法:体内实验:探讨大黄酸预处理对急性心肌梗死SD大鼠的影响。SD大鼠随机分为5组:假手术组、模型组、大黄酸组、线粒体分裂抑制剂组、比索洛尔组。对SD大鼠心脏前降支进行结扎建立心肌梗死模型。各组模型建立24小时后,行EB-TTC双染检
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目的:通过建立SD大鼠心肌梗死模型及H9c2心肌细胞缺氧损伤模型,研究大黄酸预处理对心肌细胞线粒体自噬及线粒体分裂的作用,探究大黄酸对缺氧心肌细胞的保护作用及其机制。方法:体内实验:探讨大黄酸预处理对急性心肌梗死SD大鼠的影响。SD大鼠随机分为5组:假手术组、模型组、大黄酸组、线粒体分裂抑制剂组、比索洛尔组。对SD大鼠心脏前降支进行结扎建立心肌梗死模型。各组模型建立24小时后,行EB-TTC双染检测心肌组织梗死程度;行HE染色观察心肌组织病理形态;行Masson染色观察心肌纤维化程度;TUNEL荧光检测心肌细胞凋亡;血清心肌酶谱检测心肌细胞损伤程度;透射电镜观察心肌组织超微结构;Western Blot 检测心肌组织 drp1、opa1、parkin、pink1、beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ、bax、bcl2、asp175(cleaved caspase3)蛋白水平。体外实验:探讨大黄酸预处理对缺氧引起的H9c2心肌细胞损伤的影响。H9c2心肌细胞分为5组:假手术组、模型组、大黄酸组、线粒体分裂抑制剂组、比索洛尔组。待细胞生长至80%左右,加入不同处理因素,放入缺氧培养箱培养24小时后,进行以下指标检测:CCK8活力检测;透射电镜观察H9c2心肌细胞超微结构;Annexin V/PI双染法检测H9c2心肌细胞的凋亡率;Western Blot检测心肌组织drp1、opa1、parkin、pink1、beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ、bax、bcl2、asp175(cleaved caspase3)蛋白水平。研究结果:1、EB-TTC双染结果显示:与模型组相比,大黄酸组大鼠心肌梗死程度显著减轻(11.39%±2.52%vs40.94%±6.23%);线粒体分裂抑制剂组大鼠心肌梗死程度显著减轻(19.05%±3.08%vs40.94%±6.23%);比索洛尔组大鼠心肌梗死程度显著减轻(10.79%±3.68%vs40.94%±6.23%)。与线粒体分裂抑制剂组相比,大黄酸组大鼠心肌梗死程度显著减轻(11.39%±2.52%vs19.05%±3.08%)。2、病理切片染色结果显示:与模型组相比,大黄酸组心肌纤维化范围减少,组织病变程度减轻。同样,线粒体分裂抑制剂组和比索洛尔组心肌纤维化范围减少,组织病变程度减轻。与线粒体分裂抑制剂组相比,大黄酸组心肌纤维化范围较少,组织病变程度较轻。3、TUNEL荧光检测和Annexin V/PI双染法检测结果均显示:与模型组相比,大黄酸组凋亡率降低,线粒体分裂抑制剂组凋亡率降低,比索洛尔组凋亡率降低。与线粒体分裂抑制剂组相比,大黄酸组凋亡率降低。4、透射电镜检测结果显示:与模型组相比,大黄酸组线粒体损伤减轻,线粒体自噬增强。同样,线粒体分裂抑制剂组和比索洛尔组线粒体损伤减轻,线粒体自噬增强。与线粒体分裂抑制剂组相比,大黄酸组线粒体损伤减轻,线粒体自噬增强。5、CCK8活力检测结果显示:与模型组相比,大黄酸组心肌细胞活力升高。同样,线粒体分裂抑制剂组、比索洛尔组心肌细胞活力升高。与线粒体分裂抑制剂组相比,大黄酸组心肌细胞活力增强。6、WesternBlot实验结果显示:与对照组相比,模型组的drp1、bax、cleaved caspase 3蛋白增加,opa1、beclin1、pink1、parkin、bcl2蛋白减少,LC3Ⅱ/Ⅰ比值降低;与模型组相比,线粒体分裂抑制剂组、大黄酸组、比索洛尔组的drp1、bax、cleaved caspase 3蛋白减少,opa1、beclin1、pink1、parkin、bcl2蛋白增加,LC3Ⅱ/Ⅰ比值升高。与对照组相比,模型组的 drp1、bax、cleaved caspase 3 蛋白增加,opa1、beclin1、pink1、parkin、bcl2蛋白减少,LC3Ⅱ/Ⅰ比值降低;与模型组相比,大黄酸组、线粒体分裂抑制剂组、比索洛尔组的drp1、bax、cleaved caspase 3蛋白减少,opa1、beclin1、pink1、parkin、bcl2蛋白增加,LC3Ⅱ/Ⅰ比值升高。研究结论:本课题研究表明在减轻急性心肌梗死病症方面,大黄酸能减少心肌梗死面积,改善心肌组织病理情况,减弱心肌纤维化程度,抑制心肌组织凋亡,增加心肌细胞活力,改善心肌细胞超微结构。采用线粒体分裂抑制剂抑制线粒体动力相关蛋白(drp1)后,线粒体自噬增加,心肌细胞凋亡减少,细胞活力增强,心肌组织梗死程度减轻,病理情况好转。因此我们推测大黄酸可能通过抑制线粒体裂分,增加线粒体融合,促进线粒体自噬,从而减少心肌细胞凋亡,减轻心肌损伤。
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