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目的:重症肌无力(Myasthenia Gravis,MG)是细胞免疫依赖、乙酰胆碱受体(Acetylcholine Receptor,AChR)抗体介导、补体参与、主要累及神经肌肉接头突触后膜乙酰胆碱受体的获得性自身免疫性疾病。MG发病以女性多见,20-30岁为高发期,常伴有胸腺增生;男性发病多见于40-50岁,常伴胸腺瘤及其他自身免疫性疾病。MG的发病原因尚不明确,现认为其发病与遗传、感染、自身抗体、细胞因子以及胸腺疾病等因素有关,临床治疗包括胆碱酯酶抑制剂、免疫抑制剂、血浆置换、免疫球蛋白及手术治疗等,但疗效并不理想。以往研究主要集中在抑制免疫反应和神经肌肉接头,而对线粒体能量代谢异常造成的肌细胞损伤机制研究较少。本研究包括临床研究和动物实验研究两部分。临床研究通过比较MG患者与正常人外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC)中腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated Protein Kinase,AMPK)、p38 丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)及细胞色素 c 氧化酶亚基 Ⅳ(cytochrome c oxidase subunit Ⅳ,COXⅣ)mRNA表达水平的差异,探讨能量代谢异常与MG发病的相关性,对MG的发病机制进行进一步补充;动物实验通过复制实验性自身免疫性重症肌无力(experimental autoimmune myasthenia gravis,EAMG)大鼠模型,观察EAMG大鼠骨骼肌、线粒体超微结构的变化,并检测大鼠骨骼肌AMPK、p38MAPK及COXⅣ的mRNA和蛋白表达,观察强肌健力方对EAMG大鼠能量代谢的影响,进一步明确健脾益气法改善EAMG大鼠骨骼肌能量代谢的相关机制,为健脾益气法治疗MG提供科学依据。方法:1临床研究病例标本来源于广州中医药大学第一附属医院脾胃病科2018年8月至2019年2月住院的重症肌无力患者,共收集MG患者50例,并招募健康志愿者50人作为正常组,各受试对象于清晨抽取空腹外周血并分离单个核细胞,RT-PCR法检测外周血单个核细胞中AMPK、p38MAPK及COXⅣ mRNA表达,并比较两组间的差异。2动物实验研究2.1造模:选用6周龄SPF级雌性Lewis大鼠72只作为实验对象,按随机数字表法抽取10只大鼠作为正常对照组进行常规饲养,其余62只作为模型组,对模型组大鼠进行皮下多点注射人工合成鼠源性乙酰胆碱α亚基97-116肽段,造模时间为6周。造模结束后,其中8只因症状过重死亡,剩余54只,经肌电图检测后确定成功造模43只。2.2药物干预:以随机数字表法随机抽取8只正常组大鼠及32只EAMG大鼠,将32只EAMG大鼠分为模型组及强肌健力方高、中、低剂量组(8只/组)。分组后正常组及模型组以等量生理盐水灌胃,强肌健力方高、中、低剂量组给药剂量分别为23.4 g/kg·d、15.6 g/kg·d、7.8 g/kg·d。各组大鼠灌药容积为1mL/100g体重,其浓度及等效剂量按体重折算,持续4周。2.3实验指标检测:实验结束后观察并记录大鼠体重、一般情况及Lennon评分。灌胃4周后禁食12h,处死大鼠,剪取大鼠腓肠肌组织,-80℃冰箱保存待检。电镜下观察各组大鼠骨骼肌、线粒体超微结构的变化,采用RT-PCR法检测大鼠骨骼肌AMPK、p38MAPK及COXⅣ mRNA表达变化,Western Blot法检测大鼠骨骼肌AMPK、p38MAPK、COXⅣ蛋白表达变化,比较各组间差异。结果:1临床研究1.1 一般资料:本研究共收集MG患者及健康志愿者各50例,其中MG组男性19例,女性31例,平均年龄为(42.58±13.76)岁;正常组男女各25例,平均年龄为(38.92±14.76)岁,MG患者与正常人年龄及性别无统计学差异。1.2实验结果:与正常人比较,MG患者外周血单个核细胞AMPK、p38MAPK及COXⅣ mRNA表达降低,且差异具有统计学意义(P<0.05)。2动物实验研究2.1一般情况:造模后EAMG大鼠毛发色泽枯黄,体重下降;经强肌健力方灌胃治疗后,毛发色泽改善,体重上升。2.2大鼠骨骼肌、线粒体电镜观察:研究发现EAMG大鼠骨骼肌纤维紊乱,肌膜下线粒体肿胀、空泡化、嵴断裂;经强肌健力治疗后,骨骼肌及线粒体的异常形态得到改善。2.3各组大鼠骨骼肌AMPK、p38MAPK、COXⅣ mRNA表达变化:实验结果显示,模型组大鼠COXⅣmRNA表达较正常组大鼠降低,差异有显著性(P<0.05),而模型组大鼠AMPK、p38MAPK的mRNA表达与正常组相比差异无统计学意义。强肌健力方灌胃后,高剂量大鼠COXⅣ mRNA表达水平较模型组上升,差异具有统计学意义(P<0.05),中剂量组及低剂量组COXⅣ mRNA表达较模型组有上升趋势,但差异无统计学意义。各剂量组大鼠的AMPK及p38MAPK mRNA表达与模型组相比差异无统计学意义。2.4各组大鼠骨骼肌AMPK、p-AMPK、p38MAPK、p-p38MAPK及COXⅣ蛋白表达变化:实验结果显示,模型组大鼠p-AMPK、p-p38MAPK及COXⅣ蛋白表达较正常组大鼠明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);强肌健力方高剂量大鼠骨骼肌p-AMPK、p-p38MAPK及COXⅣ蛋白表达较模型组升高,差异有统计学意义(P<0.05),中剂量组大鼠骨骼肌p-p38MAPK及COXⅣ蛋白表达较模型组升高,差异有统计学意义(P<0.05),中剂量组大鼠骨骼肌p-AMPK蛋白表达与模型组比较无统计学差异,低剂量组p-AMPK、p-p38MAPK及COXⅣ蛋白表达与模型组相比差异均无显著性。结论:1临床研究重症肌无力患者外周血AMPK、p38MAPK及COXⅣ mRNA表达水平较正常人降低,表明AMPK、p38MAPK及COXⅣ mRNA表达异常可能在MG的发病中起着一定的作用。2动物实验研究2.1皮下多点注射鼠源性乙酰胆碱受体α亚基97-116肽段可成功复制EAMG大鼠模型。2.2强肌健力方可改善EAMG大鼠毛发色泽枯黄、肌肉收缩无力、体重下降等症状。2.3 EAMG大鼠COXⅣ mRNA表达及p-AMPK、p-p38MAPK、COXⅣ的蛋白表达均下降,经强肌健力方治疗后表达均升高,故推测MG的发病可能与AMPK、p38MAPK、COXⅣ相关,强肌健力方可能通过调控其表达而发挥作用。