论文部分内容阅读
双峰驼是我国西北部地区特色动物,主要生存于荒漠地带,由于其分布地区人烟稀少,经常不被人们所重视,目前国内对双峰驼的研究较少,对双峰驼的IgM与IgE更是少有人研究。咽部是饮食和呼吸气的必经之路,经常接触病原体,因此机体为适应环境,而在此产生了丰富的淋巴组织保护口咽部,腭扁桃体是其中最大的淋巴组织。为明确IgM~+与IgE~+分泌细胞在双峰驼腭扁桃体内的分布特点及其与黏膜免疫的关系,本实验分为双峰驼IgM和IgE的原核表达、多克隆抗体的制备及运用免疫组织化学技术确定IgM~+与IgE~+浆细胞在腭扁桃体的分布三个部分:(1)为获取双峰驼IgM与IgE表达产物及多克隆抗体,首先找出GenBank收录的双峰驼IgM、IgA、IgE、IgG重链恒定区的氨基酸序列,通过比对双峰驼IgM与双峰驼IgA、IgE、IgG的氨基酸序列,选取一段差异明显的氨基酸序列,将氨基酸序列转化为对应的基因片段,对IgE也采取相同方法选取出对应基因片段。人工合成目的基因片段,PCR扩增目的基因片段,插入pET-28a(+)载体构建重组载体,转化进大肠杆菌BL21,并诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE鉴定重组蛋白。结果显示,成功构建了表达载体pET-28a-IgM与pET-28a-IgE,诱导表达并纯化出目的蛋白经鉴定也与预期相符。(2)纯化的目的蛋白分别免疫家兔制备抗血清,ELISA和Western Blot鉴定获得的血清。IgM的抗血清用ELISA方法检测,效价为1∶32000,Western Blot结果显示,IgM的兔抗血清具有良好的反应原性。IgE的抗血清用ELISA方法检测,效价为1∶16000,Western Blot结果显示,IgE的兔抗血清也具有良好的反应原性。(3)根据SABC的显色结果,将IgM~+与IgE~+分泌细胞在双峰驼腭扁桃内的分布情况分为上皮下区、网状上皮下区、滤泡区和滤泡间区。另外发现IgM~+分泌细胞在双峰驼腭扁桃体内上皮下区、网状上皮下区、滤泡区和滤泡间区都有存在,在网状上皮下区和滤泡区分布密集,且数量多,而在滤泡间区和上皮下区呈散在分布,数量较少。对IgM~+分泌细胞分布密度进行数据统计及分析得出,IgM~+分泌细胞在网状上皮下区数量显著高于滤泡间区和上皮下区(P<0.05)。滤泡间区与上皮下区的差异不显著(P>0.05)。IgE~+分泌细胞分布于上皮下区、网状上皮下区及滤泡间区,在网状上皮下区分布相对密集,数量较多,上皮下区和滤泡间区中IgE~+分泌细胞偶见。上述结果证实了,双峰驼IgM与IgE的重组蛋白成功表达及多克隆抗体的成功制备,SABC显色结果也证明了制备的兔抗血清能很好地与天然蛋白相结合,双峰驼IgM和IgE分泌细胞在腭扁桃体内的分布部位表明其具有在该些部位行使黏膜免疫功能的可能,并为之提供条件。