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目的:异丙酚(Propofol)和氯胺酮(Ketamine)作为临床静脉麻醉药,目前广泛应用于临床麻醉。已有研究采用电生理、分子生物及形态学等多项技术,对犬等动物和人的器官和组织从不同角度进行研究,研究表明异丙酚和氯胺酮对气管平滑肌均有不同程度的舒张作用,对气道起到了一定的保护作用。并认为异丙酚的这种保护作用主要与抑制迷走神经张力以及直接扩张平滑肌有关。氯胺酮舒张气管平滑肌的保护作用则可能和抑制ROC,内钙释放或PKC信号系统以及剂量依赖性开放钾离子通道有关。对于二者是否作用于细胞内钙通道以及是否通过内质网起作用,目前国内外文献报道较少。本实验利用激光共聚焦显微镜测定细胞浆内Ca 2+荧光强度峰值的改变,从而探讨不同浓度的异丙酚和氯胺酮对兔气管平滑肌细胞内钙和内质网释放钙的影响,进一步明确其舒张气管平滑肌的作用机制。方法:实验动物选择新西兰兔,雌雄不拘,体重1.5±0.3㎏。采用酶解方法获得兔的气管平滑肌细胞。选用细胞膜完整、有立体感、梭形、折光好的细胞进行荧光标记。将分离的气管平滑肌细胞离心洗涤,震荡成细胞悬液,加入5μM的FLuo-3/AM后,将细胞悬液放进37℃恒温水浴箱避光孵育30min后,于激光共聚焦显微镜下观察气管平滑肌细胞被标记情况。实验分组1.异丙酚将急性分离的气管平滑肌细胞随机分为:异丙酚组(Pro组),异丙酚+2-APB组(Pro+2-APB组)和异丙酚+ryanodine组(Pro+RyD组),每组又根据加入异丙酚浓度的不同,再将细胞随机分为:0,30,300μM异丙酚亚组。2.氯胺酮将急性分离的气管平滑肌细胞随机分为:氯胺酮组(Ket组),氯胺酮+2-APB组(Ket+2-APB组)和氯胺酮+ryanodine组(Ket+RyD组),每组又根据加入氯胺酮浓度的不同,再将细胞随机分为:0,100,1000μM氯胺酮亚组。实验流程异丙酚组(Pro组)在已用Fluo-3标记好的细胞悬液中,加入终浓度1μM的ACH,记录细胞内钙离子荧光强度峰值。用无钙的HBSS液冲洗后,分别加入终浓度为0μM(加HBSS液),30μM和300μM的异丙酚,孵育15min后,再加入终浓度1μM的ACH,记录各组细胞内钙离子荧光强度峰值。异丙酚+2-APB组(Pro+2-APB组)在已用Fluo-3标记好的细胞悬液中,加入终浓度1μM的ACH,记录细胞内钙离子荧光强度峰值。加入终浓度40μM的2-APB孵育15min后,分别加入终浓度为0μM(加HBSS液),30μM和300μM的异丙酚,与2-APB共同孵育15min后,用无钙的HBSS液冲洗三次,再加入终浓度1μM的ACH,记录各组细胞内钙离子荧光强度峰值。异丙酚+RyD组(Pro+RyD组)在已用Fluo-3标记好的细胞悬液中,加入终浓度1μM的ACH,记录细胞内钙离子荧光强度峰值。用无钙的HBSS液冲洗后,加入终浓度10μM的RyD孵育15min后,分别加入终浓度为0μM(加HBSS液),30μM和300μM的异丙酚,与RyD共同孵育15min后,用无钙的HBSS液冲洗三次,再加入终浓度1μM的ACH,记录各组细胞内钙离子荧光强度峰值。氯胺酮组(Ket组),Ket+2-APB组和Ket+RyD组中,氯胺酮各亚组浓度分别为:0μM,100μM和1000μM。实验流程方法同异丙酚各对应组。结果:1用急性酶分离方法获得的细胞种类单一,易于分辨,分离细胞数量多,成活率高,80%～90%以上的细胞台盼蓝染色鉴定为活细胞,其细胞膜完整、有立体感、梭形、折光性好。细胞形态多种多样,以蚯蚓状和香蕉状多见,占70%～80%,其他还有椭圆形、圆形及不规则形。细胞大小不一,直径12～16vm,长度约60～100vm。细胞轮廓清晰,膜表面光滑,胞内颗粒少。2与0μM异丙酚组比较,300μM异丙酚组细胞内钙离子荧光强度峰值明显降低(P<0.05)。3 Pro+2-APB共同作用后,与相应浓度0μM,30μM和300μM异丙酚组(Pro组)比较,0μM与30μM Pro+2-APB组细胞内钙离子的荧光强度峰值均有明显降低(P<0.05)。300μM Pro+2-APB组细胞内钙离子荧光强度峰值无明显降低(P>0.05)。4 Pro+RyD共同作用后,与相应浓度0μM,30μM和300μM异丙酚组(Pro组)比较,相应浓度0μM,30μM和300μM Pro+RYD组细胞内钙离子荧光强度峰值均有明显降低(P<0.05),与0μM Pro+RYD组比较,300μM Pro+RYD组细胞内钙荧光强度峰值明显降低(P<0.05)。5与0μM氯胺酮组比较,1000μM氯胺酮组细胞内钙离子荧光强度峰值明显降低(P<0.05)。6 Ket+2-APB共同作用后,与氯胺酮组(Ket组)中的各对应浓度组比较,0μM与100μM Ket+2-APB组的细胞内钙离子的荧光强度峰值均有明显降低(P<0.05)。1000μM Ket+2-APB组细胞内钙离子荧光强度峰值无明显变化(P>0.05)。7 Ket+RyD共同作用后,与氯胺酮组(Ket组)中的各对应浓度组比较,0μM、100μM与1000μM Ket+RyD组细胞内钙离子荧光强度峰值均有明显降低(P<0.05)。与0μM Ket+RyD组比较,1000μM Ket+RyD组细胞内钙离子荧光强度峰值有明显降低(P<0.05)。结论:1 30μM异丙酚对细胞内钙无影响,300μM异丙酚可以明显降低气管平滑肌细胞内钙。2异丙酚降低细胞内钙可能与其抑制内质网IP3通路有关,与内质网ryanodine通路无关。3 100μM氯胺酮对细胞内钙无影响。1000μM氯胺酮可以明显降低气管平滑肌细胞内钙。4氯胺酮可能抑制内质网上的IP3通路,抑制内质网内的钙释放,从而降低胞浆内钙浓度,而可能与内质网ryanodine通道无关。