糖链作为除核酸和蛋白质之外的第三类生物大分子,被证明在生物体中参与了一系列重要的生物学过程,因而以研究糖蛋白糖链的结构与功能关系为核心的糖组学正受到越来越多的关注。近年来糖组学在糖蛋白糖链的释放、纯化、衍生化、结构解析、定量分析以及糖链结构数据库的构建等领域都有了快速发展,为生物糖组研究提供了必要的方法工具。但是,目前糖组学在一些基础和关键性技术上仍存在障碍,主要包括:(1)糖蛋白O-糖链非还原性β-消除释放过程中peeling降解反应严重;(2)糖蛋白核心α1,3-Fuc修饰N-糖链在非还原性碱催化水解释放过程中peeling降解反应严重;(3)共价亲和吸附富集纯化糖链的方法操作简便,但是糖链回收率不稳定,不适合进行糖链定量分析;(4)缺乏一套通用、可靠的寡糖链在线LC-MS高分辨分离和高通量分析的方法;(5)各种糖链结构数据库数据复杂,检索结果专一性较差,使用不便。这些问题的存在,严重阻碍了糖组学的发展。基于此,本研究设计并发展了一系列用于糖蛋白寡糖链的释放和衍生化、纯化、高分辨率高效液相色谱(HPLC)分离分析、高通量液质联用(LC-MS)分析以及建立糖链结构数据库的新方法体系,以期使这些技术问题得到解决,为糖组学研究提供简便、可靠、通用的新方法工具。取得的主要研究结果如下:1.提出并详细阐述了 O-糖蛋白“一釜法”反应的概念和机理,从理论上揭示了其在同一反应体系中同时实现糖蛋白O-糖链的β-消除释放、释放后O-糖链的PMP衍生化标记以及O-糖基化位点的PMP标记这三个反应过程的本质和可行性。以猪胃黏蛋白为样品,首次在实验上证实了“一釜法”的可行性。设计了并完成了“一釜法”反应条件的优化,最终发展出三套不同的“一釜法”反应条件,并对其进行系统评价:NaOH-PMP“一釜法”peeling产率为1.1%,O-糖链相对产率为100%,N-糖链产率极低;NH3·H2O·PMP“一釜法”peeling产率为1.2%,O-糖链相对产率为112%,N-糖链产率最高;DMA-PMP“一釜法”peeling产率为3.3%,O-糖链相对产率为54.9%,N-糖链产率与NH3·H20-PMP“一釜法”相当。三种方法均无脱唾液酸现象,所需最少糖蛋白样品量均为100 ng左右,均无显著肽链降解,都可以在O-糖基化位点标记PMP分子。以新建立的“一釜法”成功释放并分析了牛颌下腺黏蛋白、鸡和鸭卵黏蛋白以及人乳和人精液样品中的O-糖链,证明了该方法对各种生物样品都具有良好的适用、性稳定性和可靠性。2.设计并实现了一种在同一反应体系中同时完成核心α-l,3岩藻糖基化N-糖链的碱催化水解释放和PMP衍生化标记的新型N-糖蛋白“一釜法”反应策略;基于前期建立的O-糖蛋白NH3·H2O-PMP“一釜法”,经过条件优化,证明最佳反应时间为48 h,而核心α-1,3岩藻糖基化N-糖链的peeling降解产率为5%以下;以新建立的N-糖蛋白NH3·H20-PMP“一釜法”成功释放并分析了几种植物和低等动物样品中的核心α-1,3岩藻糖基化N-糖链,证明了该方法适用于复杂生物样品N-糖链的分析。3.发展了一种利用SHPS功能材料定量富集纯化还原性糖链的新方法,并得到了一套最佳反应条件;揭示了该方法对还原性寡糖的定量动态线性范围为0.04 mM-20mM,还原性糖链的回收率为63.9%,寡糖定量分析的重现性变异系数CV值低于3.3%;该方法被成功应用于RNaseB、鸡蛋白蛋白、各种乳汁、人血浆和FBS这些生物样品中寡糖链的富集纯化和分析,表明该方法适用于各种复杂生物样品的糖组研究。4.建立了 HILIC和RP-HPLC分离寡糖链双PMP衍生物的通用新方法,获得了最佳洗脱条件;这两种方法分离不同聚合度寡糖链分子的保留时间RSD值分别小于0.76%和0.31%;二者对糖链双PMP衍生物的最低检测限均为为5 pmol左右;成功分离分析了猪胃黏蛋白、牛颌下腺黏蛋白和牛胎球蛋白上的O-糖链,并且发现HILIC主要根据分子量大小对糖链双PMP衍生物进行分离,而RP-HPLC主要根据连接方式和三维结构对糖链双PMP衍生物进行分离,为建立寡糖结构数据库提供了理论依据;成功分离分析了胎牛血清和青蛙卵包膜O-糖链,证明了新方法在复杂生物样品O-糖组分析中的适用性。5.设计并提出了 一种以HILIC相对保留时间GU值和RP-HPLC相对保留时间OMCU值构成的有序实数对来构建O-糖链结构数据库的新概念和新方法;通过进一步优化,获得了 一套以HILIC和RP-HPLC联合对O-糖链双PMP衍生物进行高分辨率分离的色谱条件;对燕窝O-糖链进行了 NaOH-PMP“一釜法”释放和高通量在线HILIC-MS/MS和RP-HPLC-MS/MS联合定性定量分析,成功分离了包括3对同分异构体在内的19种燕窝O-糖链,并成功解析了结构;成功构建了以GU值和OMCU值为基础的燕窝O-糖链结构数据库和以GU值、OMCU值和百分含量为基础的燕窝O-糖组信息数据库,为生物O-糖组研究提供了一套新的研究思路和研究方法。6.应用新建立的NaOH-PMP“一釜法”以及高分辨率、高通量在线HILIC-MS/MS和RP-HPLC-MS/MS联合分析O-糖链双PMP衍生物的方法,探索分析了肝细胞癌组织和血清与癌旁组织以及正常血清相比在各种O-糖链的结构和表达水平上的变化。结果表明,肝细胞癌组织、癌旁组织以及肝癌血清和正常血清中都只含有3种O-糖链,即T抗原、单唾液酸ST抗原以及双唾液酸ST抗原。肝癌血清与正常血清相比,这三种O-糖链在表达水平上均无显著变化。而肝细胞癌组织与癌旁组织相比,单唾液酸ST抗原和双唾液酸ST抗原表达水平变化都不显著,而T抗原的表达水平发生显著上调(p<0.05)。因此,T抗原可作为肝细胞癌糖链标志物的一种候选分子进行进一步研究。本研究进一步验证了所建立的系列新方法在复杂生物样品糖组研究中的适用性、可靠性和系统性,也为进一步系统化筛选肝癌和其它疾病糖链标志物提供了技术参考。