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植物根系的生长发育状况直接影响植物吸收环境中养分和水分。大豆是典型的直根系作物,但我们对大豆根系发育调控机制的理解还十分有限。生长素是一种重要的植物激素,在主根、侧根、不定根和根毛的生长发育中都起重要作用。已有研究证明拟南芥SLR基因是侧根形成的关键负调节因子,但目前还没有有关大豆SLR基因功能的研究。
通过此项研究,我们克隆了大豆SLR(SOLITARY-ROOT/IAA14)基因,并研究了其在根系、叶和花发育方面的功能。获得如下结果:
(1)基于EST序列比对,通过5’和3RACE(Rapid amplification of5and3cDNA ends)技术获得了大豆SLR基因全长cDNA序列。GmSLR基因全长cDNA序列为720 bp,编码含239个氨基酸的蛋白质,预测蛋白分子量约为26.4 KD。通过NCBI的同源性比对分析得知,GmSLR属于AUX/IAA蛋白家族成员,从GmSLR蛋白与AtIAA14蛋白的氨基酸序列比对可知,GmSLR蛋白与AtIAA14蛋白氨基酸相同程度达到76%,进化分析表明GmSLR与拟南芥AtIAA14进化距离最短,高度同源。此外我们还获得了SLR基因的全长基因组序列,由5个外显子和4个内含子组成。
(2)亚细胞定位试验表明,GmSLR定位于细胞核。
(3)结合利用Hi-TAIL PCR技术和大豆基因组序列信息,我们获得GmSLR转录起始上游1.8 kb启动子序列。通过PLACE等启动子分析工具,推测GmSLR启动子包含多个非生物胁迫响应和调控元件。通过对GmSLR的启动子元件分析,发现GmSLR包含许多调控元件的结合位点,如光调控、冷害反应、胁迫诱导元件等。
(4)对GmSLR的启动子融合GUS报告基因的转基因大豆毛状根的GUS染色分析,表明该基因表达具有组织特异性,其表达主要集中在根的伸长区,在根冠和根分生区不表达。组织切片分析表明GmSLR基因的表达具有细胞特异性,主要集中在中柱鞘细胞,该基因表达受生长素的诱导。
(5)半定量RT-PCR表明GmSLR基因具有时钟节律表达模式,其表达水平呈昼夜周期性变化,白天表达量比夜晚表达量高。
(6)半定量RT-PCR和荧光定量RT-PCR分析结果表明:在大豆顶芽和正在发育的种子中GmSLR基因表达量较低;在荚中GmSLR基因表达量较高;在幼苗期和成熟期侧根中GmSLR表达量维持在一个相对较高的水平。
(7)拟南芥过量表达GmSLR材料表型与野生型中没有明显差异,主根长和侧根数不受影响。
(8)过表达GmSLR第二结构域氨基酸突变的转基因烟草植株和野生型烟草植株相比,在正常生长的情况下,过表达突变GmSLR烟草植株明显不同于野生型,过表达点突变GmSLR转基因烟草植株矮小、顶端优势不明显、茎分枝增多;叶片小而不平整、叶片上表面起皱成波浪状、尤其是次级脉之间叶片上表面生长凸出;下表面凹陷、皱缩卷曲、具有下卷的叶片形态;叶片生长不对称、叶色较深、节间短;表皮毛增粗、长度增加;花器官变小、花柄变短、萼片变小变短。
综上所述,本研究克隆了大豆AUX/IAA基因家族成员GmSLR,研究了其表达模式以及其对根系、叶和花发育的影响。为将来深入研究大豆侧根、叶和花的发育打下了基础。