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链霉菌具有强大的次级代谢能力和显著的生长周期,其中,γ-丁酸内酯介导的群体感应在触发链霉菌次级代谢生物合成和形态分化过程中起着关键作用。本论文以天蓝色链霉菌γ-丁酸内酯群体感应系统为研究对象,旨在阐明该调控系统的开启和关闭调控机制,为进一步工程应用该调控系统提高抗生素产量建立理论基础。 实验室前期工作表明在天蓝色链霉菌中假γ-丁酸内酯受体ScbR2能够结合kasO启动子。本工作首先对ScbR2在kasO启动子的结合序列进行footprinting分析,发现ScbR2在kasO启动子的结合序列同γ-丁酸内酯受体ScbR的结合序列OB重合。由于信号分子SCB1合酶基因scbA启动子也存在这一顺式序列(siteA),于是通过体外EMSA实验、footprinting实验和体内荧光定量PCR、异源双质粒报告基因验证,证实ScbR2确实通过直接结合scbA启动子的siteA位点抑制该启动子的转录。进一步用LC-MS/MS对野生株和ScbR2缺失株及回补株的信号分子SCB1定量分析表明,在ScbR2缺失株SCB1在整个生长时期都表现为可检测浓度,而在野生株和回补株SCB1信号分子只在转变期检测到。因此推断ScbR2负责在了转录水平上终止群体感应信号分子的合成;继续对scbR2和群体感应基因scbA/scbR的比较转录时序分析表明,ScbR2启动时间恰好负责了群体感应信号的关闭。为了证明该机制的保守性,委内瑞拉链霉菌假γ-丁酸内酯受体JadR2关闭群体感应信号分子合酶基因jadW1启动子的角色也得到充分验证,并进一步分析发现,ScbR2和JadR2在相应启动子的结合序列比较保守,这一保守序列在其他链霉菌的信号分子合酶基因启动子也普遍存在。因此,在链霉菌中,假γ-丁酸内酯受体在转录水平上执行终止信号分子合成的角色具有普遍性。 天蓝色链霉菌群体感应基因scbA/scbR只在特定时序开启,在灰色链霉菌也有类似报道。所以,在链霉菌生长早期也应该存在一种控制机制抑制群体感应的启动。为了筛找天蓝色链霉菌的群体感应早期抑制蛋白,我们首先通过合成生物学遗传电路原理在大肠杆菌建立目标启动子的抑制蛋白筛选Biosensor;然后以scbA基因启动子为靶启动子,对天蓝色链霉菌64个TetR家族调控蛋白进行建库筛选,最终筛得4个未知抑制蛋白。其中将CprA和CprB进行重组表达纯化,通过EMSA实验表明CprA和CprB确实结合scbA启动子;进一步转录时序分析发现,这两个蛋白在生长早期有较高的转录,其中CprB较显著。所以我们初步推测CprA和CprB在天蓝色链霉菌生长早期,起着抑制群体感应启动的角色。 天蓝色链霉菌kasO启动子受到ScbR和ScbR2两个蛋白的抑制,同时还能够被链霉菌看家sigma因子HrdB识别,为了开发链霉菌通用的强启动子,我们用启动子工程的手段将kasO启动子开发成了强启动子kasOp*,并对kasOp*进行了系统表征。 综上所述,在天蓝色链霉菌中,正是由于早期抑制蛋白CprA、CprB和转变期抑制蛋白ScbR2对群体感应的适时调控,保证了群体感应行为的时序开启和关闭。同时,还用启动子工程的手段得到一个链霉菌强启动子kasOp*。